多孔菌科茯苓是我国传统大宗药材,以干燥菌核入药。萜类化合物茯苓酸药理活性丰富,是茯苓主要药效成分和药材质量指标性成分。生产上通常采用松木为栽培料生产茯苓,促使茯苓种植与森林资源保护相矛盾。解析茯苓酸合成途径有助于实现茯苓酸异源合成,减少对松木资源的消耗。根据从茯苓中鉴定到的三萜类化合物的结构特点,推导出了以羊毛甾醇为前体物质的茯苓酸下游生物合成途径,其中CYP450酶催化了多个位点羟化或羧化反应。本研究结合茯苓基因组与转录组测序结果的分析,挖掘参与茯苓酸生物合成途径中的关键CYP450酶基因,并通过靶向代谢定性定量分析在茯苓体内过表达和沉默候选CYP450基因后代谢途径中的相关代谢物含量变化,从而推导候选CYP450基因功能,以进一步深度解析茯苓酸合成途径。主要研究结果如下:1、本研究采用三代Pac Bio Sequel II测序平台对茯苓进行基因组测序,测序组装基因组大小为58.1Mb,共获得185个contig片段,contig N50长度为1,419,924bp,GC含量为51%。预测编码蛋白的基因数目为16015,其中93%的基因能够被注释到。2、在茯苓中共注释到298个CYP450酶基因,以实验室前期研究发现的参与茯苓酸生物合成的4条基因（LSS、SMT1、SOAT与Pc CYP3）为参照基因。通过基因簇分析和表达谱分析,筛选得到14条候选CYP450基因,最后选择基因表达模式相关性高的4条CYP450基因Wc CYP118、Wc CYP158、Wc CYP220与Wc CYP153进行基因功能研究。3、从茯苓中成功克隆Wc CYP118、Wc CYP158、Wc CYP220与Wc CYP153,并进行序列分析。结果表明,Wc CYP158,Wc CYP118,Wc CYP153均为不稳定亲水蛋白,Wc CYP220为稳定亲水蛋白。根据进化树与结构域分析推测Wc CYP158与Wc CYP118属于真菌CYP64-like,Wc CYP220属于CYP52家族,Wc CYP153可能属于CYP FUM15-like。对蛋白进行信号肽与跨膜结构预测,发现Wc CYP118具有信号肽与跨膜区域结构,Wc CYP153与Wc CYP220没有信号肽,但均具有跨膜区域结构,而Wc CYP158没有信号肽与跨膜结构。4、分别构建上述4个候选基因的超表达载体与沉默表达载体,并获得对应的茯苓转化菌株。q PCR结果发现,与野生型菌株进行相比,4个基因的超表达菌株的基因表达量显著上调,沉默表达菌株的基因表达量显著下调。对转化子中的代谢物进行检测,结果发现在Wc CYP118、Wc CYP153、Wc CYP220超表达菌株中,茯苓酸、16α-羟基氢化松苓酸、土莫酸与齿孔酸的含量均有提高,在Wc CYP118、Wc CYP153、Wc CYP220的沉默菌株中,茯苓酸、16α-羟基氢化松苓酸、土莫酸与齿孔酸的含量均有所降低,表明Wc CYP118、Wc CYP153、Wc CYP220对茯苓酸、16α-羟基氢化松苓酸、土莫酸、齿孔酸的合成具有正向调控作用,推测以上3个基因参与了茯苓酸的生物合成途径。综上所述,本研究推导了茯苓酸生物合成途径并基于基因组与转录组数据分析,挖掘出4个可能参与茯苓酸生物合成途径的CYP450酶基因。通过功能验证分析,发现Wc CYP118、Wc CYP153、Wc CYP220参与了茯苓酸生物合成途径,为进一步完全揭示茯苓酸生物合成途径打下了基础。