拟南芥过氧化氢酶逆境胁迫应答的分子机制研究

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植物生长过程中经常遭受各种逆境胁迫,盐胁迫是植物经常遭受的非生物胁迫之一。盐胁迫会导致细胞内活性氧(ROS)过量积累,引起氧化胁迫,影响植物生长发育。过氧化氢(H2O2)是重要的活性氧之一,其过量积累会对植物细胞产生毒害作用。过氧化氢酶(Catalase,CAT)是植物氧化防御体系中清除H2O2的主要酶类之一。拟南芥过氧化氢酶共有3种:CAT1、CAT2、CAT3,且序列相似性很高,在植物应答氧化胁迫中具有重要作用,但不同过氧化氢酶在逆境胁迫下的功能是否一致,调控机制是怎样的,不同过氧化氢酶应答逆境胁迫的具体机制这些问题尚不清楚。本论文利用可用于免疫印迹检测的特异性单克隆抗体α-CAT2和α-CAT3,能够检测植物体内三种过氧化氢酶的多克隆抗体α-Catalase,以及实验室前期工作获得的cat2、cat3、cat1/3、cat2/3、cat1/2/3等多种突变体,通过Western Blot、RT-PCR、酵母双杂交、双分子荧光互补(Bi FC)等方法对不同过氧化氢酶应答逆境胁迫的情况进行了研究,并对其应答逆境胁迫的调控机制进行了探究。蛋白免疫印迹检测结果显示,150 m M Na Cl处理及恢复条件下,拟南芥野生型材料中CAT2在胁迫处理期被诱导,而CAT3在盐胁迫处理的恢复期被大量诱导。利用α-Catalase检测cat2/3盐胁迫应答以指示CAT1的表达发现,CAT1盐胁迫应答与CAT2一致,但与CAT3不同。通过甘露醇(Mannitol)和甲基紫精(MV)模拟的干旱胁迫和氧化胁迫验证了CAT2和CAT3对其它胁迫条件的应答规律与盐胁迫基本一致。RNA水平的分析结果显示CAT2和CAT3盐胁迫响应不同可能受转录水平调控。为了进一步验证过氧化氢酶的逆境胁迫应答机制,本论文构建了pro CAT2:CAT2-p CAMBIA3301、pro CAT2:CAT3-p CAMBIA3301、pro CAT3:CAT2-p CAMBIA3301、pro CAT3:CAT3-p CAMBIA3301,及荧光蛋白融合表达载体pro CAT2:EYFP-CAT2-p CAMBIA3301、pro CAT3:Ds Red-CAT3-p CAMBIA3301,通过农杆菌花序浸染法获得转基因株系,待后续实验进一步研究盐胁迫应答的调控机制。本文还通过泛素蛋白酶体途径和细胞自噬途径对CAT2和CAT3的降解进行了研究以探究胁迫应答与过氧化氢酶降解的关系。细胞自噬途径中ATG基因相关(Autophagy-related)的ATG2和ATG7突变在正常的生理状态下使CAT2和CAT3大量积累,但两基因突变对CAT2和CAT3的盐胁迫应答影响较小。在盐胁迫应答中CAT3的降解在泛素蛋白酶体抑制剂存在下被抑制,酵母双杂交结果显示具有Catalase活性的部分区域CAT2M和CAT3M与泛素蛋白酶体中的F-box蛋白EBF2(EIN3 Binding F-box Protein 2)相互作用,Bi FC实验验证CAT与EBF的互作关系没有得到明确的结果。本研究的创新点在于我们在蛋白水平对不同过氧化氢酶进行了区分探究,证明了不同过氧化氢酶在逆境胁迫中的表达规律不同,这种响应在盐胁迫下可能受转录水平的调控,这暗示着不同过氧化氢酶在逆境胁迫下发挥的功能不同。对过氧化氢酶的降解进行了初步探究,在盐胁迫应答中,CAT3可能通过泛素蛋白酶体途径降解,ATG2和ATG7参与的细胞自噬途径对盐胁迫下过氧化氢酶应答的影响较小。这些结果对于探究拟南芥不同的过氧化氢酶逆境胁迫应答机制及其降解机制具有一定的创新价值。
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