论文部分内容阅读
第一部分：筛选有效抑制血管内皮细胞caveolin-1表达的siRNA及其毒性检测目的筛选有效抑制血管内皮细胞小窝蛋白-1（caveolin-1）表达的小干扰RNA（small interference RNA, siRNA）序列，并检测转染复合物的细胞毒性。方法设计合成针对caveolin-1的siRNA3条（siRNA422,siRNA548,siRNA710）及一条带绿色荧光标记的通用阴性对照FAM-siRNA。在siRNAFect（siRNA transfectionreagent）介导下转染血管内皮细胞。用Real-Time PCR测定转染后血管内皮细胞中caveolin-1mRNA的表达，Western blot方法测定干扰后caveolin-1蛋白表达，比较抑制率，筛选出有效抑制caveolin-1表达的siRNA。采用磺基罗丹明B法（sulforhodamineB，SRB）分析转染复合物的细胞毒性。结果①在siRNAFect相同剂量下，siRNA20、30或40nmol L-1组转染效率均达到85%以上（P<0.01）；②siRNAFect1.3μL复合10或20nmol L-1siRNA组细胞存活率均达到80%以上（P<0.05）；③siRNA548对EA.hy926细胞caveolin-1基因mRNA抑制效果最明显（P<0.01）;④与阴性对照组及siRNA422、siRNA710相比，siRNA548干扰血管内皮细胞48h后,caveolin-1蛋白的表达量最低（P<0.01）。结论①siRNA548对血管内皮细胞caveolin-1表达的抑制效果最大。②siRNA浓度20nmol·L-1复合siRNAFect1.3μL转染效率高，细胞毒性低，适合转染。第二部分：Caveolin-1通过NF-κB途径调控LPS诱导血管内皮细胞F-actin的重组目的探讨小窝蛋白-1（caveolin-1）在脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）诱导血管内皮细胞纤维状肌动蛋白解聚中的作用及其可能的调节机制。方法以人脐静脉内皮细胞株（EA.hy926细胞株）为研究对象，细胞生长稳定贴壁融合后，根据不同的处理分为四组，每组6复孔：1)对照组（C组）；2)LPS10μg/ml组（L组）；3)LPS10ug/ml+cav-1-siRNA548预处理组（S组）；4) LPS10μg/ml+cav-1-siRNA548+L-NAME （N-硝基-L-精氨酸甲酯）10μM预处理组（N组）。根据LPS的作用时间，每组进一步分为1、3、6和12小时组。使用Real-Time PCR测定各组peNOS-s1177和NF-κB的表达，同时采用直接免疫荧光染色法观察各组F-actin的变化。结果（1）与对照组比较，各时间点L组和S组的peNOS-s1177表达均明显增加（P<0.01），其中S组peNOS-s1177表达更为显著（P<0.01）；与1h组比较，L组peNOS-s1177在6h时达到最大值（P<0.01），12h时表达开始减少（P<0.05）；而在S组，peNOS-s1177在3h达到最大值（P<0.05），之后6h和12h表达逐渐减少（P<0.01）；（2）与对照组比较，各时间点L、S和N组的NF-κB表达均明显增加（P<0.01），其中L和N组的NF-κB在各时间点增加更为显著（P<0.01），而L组和N组之间表达无差异（P>0.05）。在S组，NF-κB在3、6和12h表达显著降低（P<0.01）；（3）直接荧光染色发现在给予LPS6h后，EA.hy926细胞株F-actin出现明显的解聚和重构，其程度随着时间的增加而加重。而采用cav-1-siRNA548预处理细胞株后，F-actin的解聚和重构发生时间明显推迟且程度较轻，并且L-NAME可以逆转上述作用。结论（1）caveolin-1参与了LPS诱导血管内皮细胞F-actin解聚的调控；（2）caveolin-1可能通过eNOS-NF-κB途径来调控F-actin的解聚和重构。