论文部分内容阅读
MicroRNA(简称miRNA)是一类长约18-22个核苷酸的小分子RNA,它们组成了机体内的RNA调控网络,可以在多水平控制基因的表达。参与了细胞增殖、分化和凋亡的调控,影响着动物和植物的生长发育以及各种病理过程。要了解miRNA在机体生理、病理过程中的表达情况及其所发挥的重要作用,就需要有合适的方法对miRNA进行准确的检测,从而才能够开展更为深入的功能性研究。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)可以对目标分子实现精确定量,是目前一种常用的miRNA检测手段。本研究在qRT-PCR的基础上,建立一种灵敏、特异的miRNA通用探针检测方法,以达到仅利用一种检测探针和下游引物实现对多条miRNA进行检测的目的。布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种严重的人兽共患传染病,对人类健康和畜牧养殖业造成了极大危害。布鲁氏菌具有多种毒力因子,通过逃避巨噬细胞的杀伤作用达到胞内生存的目的,与机体细胞免疫反应密切相关,其中四型分泌系统(Type IV secretion system,T4SS)是一种重要毒力因子。布鲁氏菌借助T4SS将相关效应蛋白或毒素通过细胞膜分泌到宿主细胞内造成持续感染,而编码T4SS的基因受vir B操纵子编码,所以virB对布鲁氏菌的胞内生存和毒力具有十分重要的影响。敲除virB启动子毒力基因可以关闭T4SS,最终导致突变型存活率降低,不进行持续感染,本实验即利用了实验室构建保存的16M菌株vir B基因缺失株。分别用布鲁氏菌16M和16M△virB菌株感染小鼠巨噬细胞RAW264.7、建立BALB/c小鼠感染模型,观察毒力引起的宿主microRNA-155(miR-155)表达水平变化。最终应用通用探针检测方法,对123例医院临床血清样本miR-155表达水平进行了统计分析。miR-155是一种与免疫相关的小分子RNA,在多种病原微生物感染后表达水平均发生变化,可以参与到病原微生物致病过程。本实验建立并应用通用探针检测方法,将该方法应用于临床样本检测,探讨布鲁氏菌感染后宿主miR-155的表达规律,挖掘miR-155作为诊断布鲁氏菌病特征性标识的可能性。具体研究内容及结果如下:一、通用检测方法的建立(1)逆转录引物设计设计Uni-RT12、Uni-RT12A、Uni-RT12C、Uni-RT12G、Uni-RT12V、Uni-RT12VN共6种逆转录引物,在人工合成的microRNA-146a(miR-146a)模拟物和临床血浆样本中比较各引物的差异。为二者的总RNA加Poly(A)尾,分别用以上6种逆转录引物进行逆转录,扩增6种逆转录产物中的miR-146a,扩增时使用设计的同一种通用探针和通用下游引物。根据qRT-PCR结果判断扩增效果。利用高分辨溶解曲线(High-resolution melting,HRM)分析各逆转录引物特异性,最终筛选出特异性最强的逆转录引物。结果显示,在检测实际样本时,Uni-RT12A和Uni-RT12VN获得了较好的效果。进一步通过HRM分析,发现Uni-RT12A的溶解曲线峰值最高,没有波肩,峰的跨度最小,特异性最好。(2)反应体系优化利用正交实验设计,选定三因素四水平,具体如下:三个独立因素即试剂盒种类、退火温度和通用探针浓度,试剂盒种类包括GoldStar TaqMan Mixture(Low ROX)、Premix Ex Taq(Probe qPCR)、2×EasyTaq PCR SuperMix和SuperReal PreMix(Probe)。退火温度分别为62℃、60.7℃、58.4℃和55℃,通用探针浓度分别为0.2μM、0.4μM、0.6μM和0.8μM。在miR-146a模拟物中进行L16(4)3正交实验,共16次实验,通过直观分析法比较各次实验结果。结果表明,在使用2×GoldStar TaqMan Mixture、退火温度为58.4℃、探针浓度为0.6μM时效果最佳。(3)通用探针检测方法评价通过与实验室较为常用的SYBR Green I染料法比较,对通用探针法的性能、通用性和扩增范围进行评价。性能(特异性和灵敏性)比较:TRIzol法提取10例健康志愿者血浆总RNA制成混合样本,加Poly(A)尾后分别取不等量产物用于逆转录,分别用染料法和通用探针法进行qRT-PCR扩增miR-146a、miR-122、miR-155,比较两种方法的差别。通用性评价:分别用这2种方法扩增随机挑选的8条miRNA,证明该方法对miRNA普遍适用。扩增范围分析:将已知浓度miR-146a模拟物逆转录后10倍梯度稀释,分析该方法的扩增范围。结果表明,通用探针法特异性和灵敏性均高于染料法,扩增范围0.2μM-0.2×10-4μM,在临床样本中可以检测miR-155、miR-146b、miR-223、miR-181c、miNA-27a、mi R-29a、miR-29b-1、miR-146a共8条miRNA,具有较好通用性。二、布鲁氏菌病感染后宿主miR-155表达规律研究(1)RAW264.7细胞侵染实验用布鲁氏菌16M和16M△virB菌株接种小鼠巨噬细胞RAW264.7,阴性对照组接种PBS,在第0、24、和48小时裂解细胞提取总RNA,分别检测miR-155表达水平,采用相对定量(Relative Quantification,RQ)分析miR-155随时间变化及组间差异。结果显示,小鼠巨噬细胞在感染16M后的24小时,miR-155表达水平升高,在感染16M△virB后的0至48小时,miR-155表达水平降低。(2)BALB/c小鼠感染实验分别用布鲁氏菌16M和16M△virB菌株感染BALB/c小鼠,建立小鼠感染模型,以PBS作为阴性对照,在第7、14和28天提取小鼠脾脏总RNA,分别检测miR-155表达水平,采用相对定量分析miR-155随时间变化及组间差异。结果显示,小鼠内源miR-155表达水平在感染16M后的7和14天被抑制,但是第28天升高,miR-155表达水平在感染16M△virB后的7天和14天与16M相反。在第7天时,感染16M△virB后的mi R-155表达水平明显高于16M。(3)临床样本检测收集布鲁氏菌病患者、非布鲁氏菌感染者和健康志愿者血清样本,分别提取血清总RNA,采用绝对定量(Absolute Quantification,AQ)的方法检测血清中miR-155表达水平,分析组间差异,统计样本基本信息,分析血清miR-155的表达水平与抗体滴度和临床症状之间的相关性。结果显示,布鲁氏菌病患者血清miR-155表达水平与非布鲁氏菌感染者和健康志愿者相比被显著抑制,分析病例信息,血清miR-155表达水平与布鲁氏菌抗体滴度(P<0.05)和临床症状(盗汗)(P<0.05)明显相关。综上所述,本研究建立了一种miRNA检测新方法,与SYBR Green I染料法相比特异性高、反应灵敏,一次可检测多条miRNA,在进行大量样本检测时具有较大优势。将该方法应用于医院临床样本miR-155的检测中,发现布鲁氏菌病患者与非布鲁氏菌病感染者和健康志愿者相比,miR-155表达水平具有显著性差异,布鲁氏菌病患者血清miR-155与抗体滴度和临床症状(盗汗)呈正相关,提示miR-155可作为布鲁氏菌病诊断的一个分子标识。在早期感染中,布鲁氏菌16M感染细胞和小鼠后,宿主miR-155表达水平低于布鲁氏菌16M△virB,初步表明布鲁氏菌干扰了miR-155介导的宿主免疫应答反应,这种干扰可能与virB或者T4SS有关,具体机制需要进一步探讨。