家蚕基因启动子活性分析和马氏管内生免疫初步研究

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本论文的研究内容分为两部分:一、家蚕组织特异性和时空特异性基因启动子活性分析家蚕(Bombyx mori)是一种重要的经济昆虫,也是鳞翅目的模式昆虫,一生经历卵、幼虫、蛹和成虫四个发育时期,属完全变态昆虫。家蚕的整个发育过程都是大量的基因按照一定的时间、空间和次序表达的结果,基因表达调控受启动子的控制。从家蚕基因组DNA中克隆了卵巢特异性非编码RNA基因(ovary non-coding RNAgene, ONCR),中肠特异性浓核病抗性基因(nonsusceptibility to DNV-2 gene, Nsd-2)和卵期特异性孵化酶样基因(Bombyx mori hatching enzyme-like gene, BmHEL)的启动子调控区,分别以luc和EGFP为报告基因,构建了系列报告质粒,借助脂质体转染细胞技术和基因枪技术,对ONCR、Nsd-2和BmHEL启动子的功能特性进行了分析研究,发现克隆得到的ONCR、Nsd-2和BmHEL基因的启动子调控区域在BmN细胞系中具有转录活性,但活性比较低,推测在BmN细胞系中可能缺少组织特异性表达所需的转录因子。利用基因枪进行组织水平的活性分析时,没有检测到转录活性的显著性结果,有待于进一步实验验证。本研究结果为筛选获得可用于转基因家蚕研究的特异性启动子提供了基础信息。二、家蚕马氏管内生免疫研究一般认为脂肪体是家蚕免疫应答的主要器官,而对于家蚕马氏管内生免疫研究,迄今为止还未见相关报道。以果蝇中马氏管内生免疫研究获得的成果为参照,对家蚕马氏管内生免疫展开研究。首先通过抑菌实验,发现离体的家蚕马氏管同果蝇马氏管一样,具有抑菌活性,说明家蚕马氏管也能够不依赖于脂肪体而产生免疫应答;其次,构建重组病毒BmNPV-EGFP,利用rBmNPV-EGFP对5龄起蚕进行侵染,并对侵染时相进行了观察,发现rBmNPV-EGFP对马氏管组织的侵染发生在侵染的后期;最后,借助双向电泳(2-D)技术对不同侵染时相的马氏管组织的蛋白进行了分离,选择出差异蛋白点进行了质谱分析,其中获得的一个可信结果是家蚕质子转移ATP合酶β亚基(β-H+ATPase)。对β-H+ ATPase进行了不同侵染时相的定量分析,发现β-H+ ATPase在不同的侵染时相表达量不同,推测其在家蚕马氏管的内生免疫中具有生物学功能。通过对家蚕马氏管内生免疫的初步研究,为其免疫功能的深入研究奠定基础。
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