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增生性玻璃体视网膜病变(PVR)是视网膜剥离手术治疗后和眼外伤的一系列严重并发症。目前对于PVR的治疗除手术外,仍没有理想的方法。本课题从超声靶向破坏微泡(UTMD)增强基因转染角度出发,探讨UTMD联合RNA干扰治疗PVR的可行性,主要包括以下三方面内容:
第Ⅰ部分
目的:探讨玻璃体腔注射视网膜色素上皮(RPE)细胞-J和富含血小板血浆(PRP)制作Wistar大鼠PVR模型的可行性,为研究PVR的治疗方案提供与人类具有较大同源性的动物模型。
方法：选取Wistar大鼠,对照组玻璃体腔注射10μl生理盐水(NS)；实验组玻璃体腔分别注射10μl RPE-J细胞(3×105/眼)、10μl PRP(含血小板2.5×109/眼)、10μl RPE-J细胞+PRP(含RPE-J细胞3×105,血小板2.5×109/眼)。注射后于一定时间点分别行眼底摄片,眼组织学检查观测眼底病理变化,免疫组织化学分析参与病理过程的主要细胞类型,酶联免疫吸附(ELISA)测定TGF-β2、PDGF-AA和PDGF-BB的表达。
结果：对照组和RPE-J细胞注射组未见增生反应。PRP注射组和RPE-J细胞+PRP组相继出现一系列病理变化包括:炎性细胞浸润、胶原产生、视网膜皱襞、增生膜形成和视网膜剥离。参与该病理过程的细胞主要有成纤维细胞、神经胶质细胞、RPE细胞和巨噬细胞。ELISA检测示TGF-β2,PDGF-BB(而不是PDGF-AA)出现了高表达,与对照组相比有显著性差异。PRP组较RPE-J细胞+PRP组的成模率明显低,持续时间亦较短。
结论：玻璃体腔注射RPE-J细胞+PRP可以成功诱导Wistar大鼠产生PVR模型,TGF-p2和PDGF-BB参与了该PVR模型疾病的发生、发展,为进一步研究PVR的治疗奠定了基础。
第Ⅱ部分
目的:探讨UTMD增强脂质体转染,并介导TGF-β2-siRNA和PDGF-BB-siRNA治疗大鼠PVR的可行性。
方法：1.玻璃体腔单独注射Cy3-siRNA(0.2nmol)+脂质体或辅以UTMD(1MHz,2W/cm2,5minutes,50％DC,100Hz,25％SonoVue),12小时后行视网膜铺片,荧光显微镜观测红色荧光的数量和亮度。2.对wistar PVR模型鼠,玻璃体腔单独注射TGF-p2-siRNA+PDGF-BB-siRNA+脂质体做为对照组,实验组另辅以UTMD(参数同上),分第3天一次给药和第3、14天两次给药两种给药方式,给药后48小时行解剖显微镜眼底摄片,组织学检查检测眼底病理变化,ELISA、实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)分别测定TGF-β2、PDGF-BB的蛋白和mRNA的表达。
结果：1.Cy3-siRNA+脂质体辅以UTMD作用后,视网膜红色荧光明显增多,亮度亦较强。2.第5天观测一次给药眼底增生改变较对照组轻微,TGF-β2、PDGF-BB的蛋白和mRNA表达均小于对照组,但第16天观测,第3、14天两次给药无论是眼底病理改变还是TGF-β2、PDGF-BB的表达在一次给药组、两次给药组及对照组间无明显差异。
结论：1.UTMD可以增强玻璃体腔注射的脂质体介导siRNA转染视网膜,为后续实验提供依据。2.TGF-β2-siRNA和PDGF-BB-siRNA于第3天一次给药,无论是否辅以UTMD,均可以暂时抑制大鼠PVR TGF-β2、PDGF-BB的分泌,延缓疾病的发展；而第3、14天两次给药却未能有效抑制PVR的发展。
第Ⅲ部分
目的:探讨UTMD增强rAAV转染,并介导TGF-β2-siRNA治疗大鼠PVR可行性。
方法：对Wistar PVR模型鼠,玻璃体腔单独注射rAAV-TGF-β2-siRNA-EGFP(2.16×109v.g)做为对照组,实验组另辅以UTMD(1MHz,2W/cm2,5minutes,50％DC,100Hz,20％SonoVue),第3天一次给药,于第14天和第28天行解剖显微镜眼底摄片,组织学检查观测眼底病理改变、ELISA、RT-PCR分别测定TGF-β2的蛋白和mRNA的表达,并于第28天行视网膜铺片,荧光显微镜观测视网膜绿色荧光的数量和亮度。
结果：1.UTMD联合rAAV-TGF-β2-siRNA-EGFP治疗组,视网膜绿色荧光明显增多,亮度亦较强。2.第14天观测UTMD联合rAAV-EGF-β2-siRNA-EGFP治疗组眼底增生改变较对照组轻微,TGF-β2的蛋白和mRNA表达均明显小于对照组；第28天观测,该组30％的病例虽然达到了PVR4级,但70％的病例病理改变还是较对照组明显轻微,较单独rAAV-TGF-β2-siRNA-EGFP治疗组亦有所减轻,TGF-β2的蛋白和mRNA表达亦明显低于对照组。
结论：1.UTMD明显增强了玻璃体腔注射的rAAV转染视网膜,为rAAV-TGF-β2-siRNA玻璃体腔给药治疗PVR奠定了基础。2.UTMD联合rAAV-TGF-β2-siRNA可以有效抑制大鼠TGF-β2的表达,在一定程度上抑制了PVR的发展。