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菊花(Chrysanthemum ×morifolium Ramat.)被誉为“东方之花”,在世界花卉市场上占有重要的份额。能否适时开花对菊花的周年生产和经济价值的实现十分重要。因为菊花是专性的短日照植物,因此在实际生产中人们主要使用调整光周期的方式调控菊花的花期,但存在费时费力成本高等问题。在临界光周期确定的前提下,成熟态菊花成花的关键在于其响应短日照诱导的敏感性。快速响应短日照诱导开花的菊花品种可以极大地降低生产成本。因此从分子水平上解析菊花响应短日照信号成花的作用机制至关重要。通过对高等植物响应光周期信号的成花机制进行分析发现,隐花色素(Cryptochrome,CRY)在特异地识别诱导型光周期信号调控成花上发挥了重要作用。通过操纵菊花的隐花色素基因改变其对光周期的响应特性具有重要的实际意义。目前关于植物隐花色素的研究多集中在隐花色素对CO(CONSTANS)蛋白以及FT(FLOWERINGLOCUS T)基因的直接调控途径上,关于隐花色素通过调控昼夜节律钟相关基因表达进而影响成花转变的机制还不清楚。由于菊花的遗传背景比较复杂,因此关于菊花响应短日照信号成花的作用机制研究进展缓慢。本研究以菊花的近缘野生种甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)为试验材料,通过对隐花色素调控甘菊成花转变的功能以及信号转导途径进行研究,以解析隐花色素介导短日照信号诱导甘菊成花转变的机制。本研究获得的主要结果如下。1.对短日照诱导不同天数下甘菊茎尖形态以及叶片中FT/TFL7相关基因的表达模式进行分析发现,短日照诱导0～8 d时,甘菊茎尖由圆锥状变为圆顶状,此时ClFT7响应短日照的诱导上调表达,而ClFT2随着短日照的诱导呈下调表达。说明短日照诱导0～8 d是甘菊成花转变的关键阶段。利用3’ RACE技术,从甘菊转录组里分离得到了 3个甘菊隐花色素基因的全长cDNA序列,分别命名为ClCRY1a、ClCRY1b和ClCRY2。对ClCRYs响应短日照诱导的表达模式进行分析发现,短日照诱导0～8 d时3个ClCRYs均呈现出上调表达。进一步对甘菊成花转变关键阶段中ClCRYs在长日照(16 h光照/8 h黑暗)和短日照(12 h光照/12 h黑暗)条件下的表达模式进行分析发现,ZT(Zeitgeber Time)=12～24 h时ClCRY1a在短日照条件下的表达量高于长日照;ClCRY1b和ClCRY2在短日照条件下的表达量均高于长日照。上述结果说明,ClCRYs可能参与了甘菊响应短日照的成花转变。2.对分别过表达ClCR Y1a、ClCRY1b和ClCRY2的转基因拟南芥的成花表型以及成花相关基因的表达模式进行分析发现,长日照和短日照(8 h光照/16 h黑暗)条件下,转基因植株莲座叶片中FT基因的表达均发生上调,致使转基因拟南芥开花时间显著提前。上述结果说明3个ClCRYs均能促进成花转变。3.将3个ClCRYs基因分别在甘菊中过表达,并对野生型和转基因甘菊的成花表型和光周期途径中成花相关基因的表达水平进行比较分析。结果发现野生型甘菊需要48.8 d的短日照才能开花;而转基因甘菊仅需33.2～41.7 d的短日照便能开花。ClCRY1a 通过上调 ClELF4、ClPRR37、ClZTL、ClFKF1、ClCOL1、ClCOL2、ClCOL4和ClCOL5的表达,抑制ClPRR73和CtRVE8的表达从而促进CTFT7的表达;ClCRY1b通过上调 ClELF4、ClPRR37、CtZTL、ClFKF1、ClGl-1、ClGI-2、ClCOLl、C7COL2、ClCOL4和ClCOL5的表达,抑制ClRVE8的表达从而促进ClFT7的表达;ClCRY2上调 ClPRR5、ClZTL、ClFKF1、ClGI-1、ClGI-2、ClCOL1、ClCOL4和 C7COL5 的表达;抑制 C7ELF3、ClELF4、ClLHY、ClPRR73和ClRVE8的表达从而促进ClFT1的表达。上述结果表明,C7CRYs能够通过上调昼夜节律钟相关基因、ClCOLs和ClFT1的表达增强甘菊响应短日照成花的敏感性。4.以甘菊成花转变关键阶段的中部叶片为材料构建酵母双杂交cDNA文库,以CICRYs为诱饵对该文库进行筛选,获得了一个昼夜节律钟蛋白CIRVE8。通过对CIRVE8 与 CICRYs 以及甘菊成花的关键 CICOLs 蛋白(CICOL1、CICOL2、CICOL4和CICOL5)间的互作模式进行分析发现,CIRVE8既能与CICRYs发生互作也能与CICOLs蛋白发生互作,而CICRYs与CICOLs蛋白之间不存在直接相互作用。据此提出,CIRVE8可能是CICRYs介导短日照信号成花过程中的一个重要信号蛋白。综合上述研究结果,作者总结出甘菊隐花色素识别光周期信号调控成花转变的作用模型:甘菊依赖叶片中的隐花色素识别外界环境中的短日照信号,隐花色素通过调控昼夜节律钟相关基因的表达,上调ClCOLs基因的表达,诱导ClFT1的表达,最终促进甘菊成花。此外,C1RVE8蛋白可能参与了甘菊隐花色素介导的信号转导过程。本研究为从根本上改良菊花响应短日照诱导的敏感性奠定了理论基础。