狂犬病病毒属于弹状病毒科-狂犬病病毒属,感染一切温血动物,在全球范围内均有流行,狂犬病为人兽共患病,一旦发病,无有效治疗药物,致死率几乎100%。我国野生动物狂犬病流行情况尚无详细数据,但时有由野生动物咬伤导致的人狂犬病发病死亡病例发生,也有从死亡野生动物尸体标本分离到狂犬病病毒的情况,说明我国野生动物存在狂犬病流行。据欧美等发达国家防控经验,消灭野生动物狂犬病的有效途径是野外投放口服狂犬病疫苗,而我国尚无野生动物口服狂犬病疫苗使用,目前市售产品有灭活疫苗或减毒活疫苗,均为肌肉注射,不适用于野生动物。因此研制可规模化生产的野生动物口服狂犬病疫苗对我国野生动物狂犬病的防控具有重要意义。针对上述内容,本研究开展了以下试验:1.狂犬病病毒减毒株的筛选。试验内容:①毒株在鼠脑连续传代。对分离自我国宁夏地区的一株狂犬病病毒CNX8601株在鼠脑连续传代,检测病毒潜伏期、病毒滴度和外周致病性。②毒株在Vero细胞连续传代。对鼠脑适应CNX-M株在Vero细胞上进行连续传代,检测病毒潜伏期、病毒滴度和外周致病性。③减毒株筛选及纯化。应用蚀斑法筛选5株减毒株,进行初步致病性及免疫原性评价。2.生物反应器培养高免疫原性狂犬病病毒。试验内容:①生物反应器高密度培养Vero细胞。应用NBS公司14L生物反应器及片状载体灌流式培养Vero细胞,摸索细胞培养条件,通过14个批次试验,确定pH、Do、温度、培养基灌流速度等参数。②生物反应器狂犬病病毒培养。以Vero细胞为基质,应用NBS公司14L生物反应器及片状载体灌流式培养收获病毒液,通过9个批次试验,确定加毒时间、病毒感染复数(MOI)、病毒收获时间等参数。③荧光法病毒滴度检测方法的建立。3.脂质体口服减毒活疫苗的制备及性质考察。试验内容:①疫苗的配制。应用反相蒸发法制备脂质体,脂质体与减毒活疫苗1:1配比后,冻干制成脂质体减毒活疫苗。②电镜观察脂质体包裹病毒颗粒形态,检测粒径分布并检测粒径大小。4.脂质体口服减毒活疫苗在小鼠体内免疫效果观察。试验内容:制备减毒活疫苗及脂质体减毒活疫苗,分别对小鼠进行口服免疫,检测小鼠体内产生中和抗体水平及细胞免疫水平。5.脂质体口服减毒活疫苗的免疫剂量。试验内容:以比格犬为动物模型,以鸡头为诱饵,分2ml、4ml和8ml剂量口服免疫脂质体减毒活疫苗,检测阳转率、血清中和抗体水平及免疫持久性。通过以上实验,获得以下结果:1.狂犬病病毒减毒株筛选结果显示:①CNX8601株在鼠脑连续传代50代,命名为CNX-M,其潜伏期由起始的11～14天,稳定到5～7天;病毒滴度能达到5.671gLD50/0.03ml,皮下致病力为1.51gLD50/0.03ml,将街毒适应为鼠脑固定毒。②鼠脑适应的固定毒通过Vero细胞适应传代50代,命名为CNX-V,其病毒滴度逐渐上升,能达到6.31gLD50/0.03ml,皮下致病力为1.51gLD50/0.03ml,将脑固定毒适应为细胞培养毒株。③用CNX-V株进行蚀斑纯化及鼠脑回传提高病毒滴度,筛选出一株减毒株,命名为CNX-V-5,小鼠口服一次0.2ml,无小鼠致病性,中和抗体水平达到1.5IU/ml,阳转率达到90%。2.生物反应器培养高免疫原性狂犬病病毒结果确定以下工艺参数:①Vero细胞接种密度为4～6×106个/ml,细胞培养阶段各参数设定值为pH7.2、溶氧70%、搅拌转速100rpm、葡萄糖维持在0.5。②CNX-V-5毒株的感染复数为0.1,病毒培养阶段的各参数设定值为pH7.4、溶氧70%、搅拌转速100rpm、葡萄糖维持在0.3。3.脂质体口服减毒活疫苗的制备及性质考察结果显示,透射电镜观察可见本方法制备的脂质体粒径分布均匀,呈圆形或椭圆形,狂犬病毒脂质体平均粒径为14.25μm左右,平均包封率为68.6±3.68%。4.小鼠体内免疫效果研究结果显示:①所有32只小鼠均未见发病情况,说明该减毒疫苗没有对小鼠产生致病性。②中和抗体比较:脂质体减毒活疫苗组中和抗体1-6个月稳定维持在3IU,灭活疫苗中和抗体水平持续在2IU,两组比较有统计学差异。③致T淋巴细胞亚群分型:脂质体减毒活疫苗组CD3+,CD4+比例均高于减毒活疫苗组。脂质体减毒活疫苗组与减毒活疫苗组之间比较CD4+/CD8+,p<0.05,差异有显著意义。④NK细胞活性:减毒活疫苗组与脂质体减毒活疫苗组之间比较,t=0.301,p>0.05,差异无显著意义。⑤IL-2检测:脂质体减毒活疫苗组同减毒活疫苗组比较,t=2.55,p<0.05,有显著性差异。⑥IFN-γ检测:脂质体减毒活疫苗组同减毒活疫苗比较,t=3.33,p<0.01,差异有非常显著性意义。5.脂质体口服减毒活疫苗的免疫剂量研究结果显示:①阳转率观察:2ml剂量组第1个月阳转率为100%,第3个月为80%,到第6个月降至60%,第15个月降至30%;4ml剂量组前3个月阳转率均为100%,前12个月为90%,第15个月为80%;8ml剂量组前9个月阳转率均为100%,第15个月为90%。②中和抗体水平:8ml剂量组中和抗体水平最高,4ml剂量组居中,2ml剂量组中和抗体水平最低,同时随免疫后时间的延长,3组的中和抗体水平均呈下降趋势。通过以上结果,得出以下结论:1.成功筛选和适应了狂犬病病毒减毒疫苗株:CNX-V-5,应用该毒株制备的减毒活疫苗未能对小鼠和犬产生致病性,同时可诱导小鼠和犬产生具有保护性的中和抗体。2.建立了生物反应器规模化培养狂犬病病毒的生产工艺,该工艺的建立为野生动物脂质体口服减毒活疫苗的规模化培养提供了技术支持,同时也将降低将来大规模使用的生产成本。3.建立了脂质体的制备方法,将此脂质体溶液与病毒收获液等体积混合,冻干制备脂质体口服减毒活疫苗。该疫苗的脂质体包封率为68%左右,平均粒径为14.25μm。4.脂质体作为狂犬病减毒活疫苗的佐剂,以小鼠为动物模型,对小鼠体内的中和抗体及细胞免疫均起到了加强作用。5.以犬为动物模型,初步摸索了脂质体口服减毒活疫苗的使用剂量及投放诱饵,试验结果表明以鸡头为诱饵,4ml和8ml的免疫剂量均产生较好的免疫效果。论文创新点:1.为我国野生动物疫苗生产获得了第一个具有自主知识产权、免疫原性好的狂犬病疫苗减毒株候选株。2.完成Vero细胞生物反应器高密度培养的研究,建立Vero细胞高密度培养工艺,Vero细胞培养密度>107个/ml,是常规培养细胞密度106个/ml的10倍。3.首次将脂质体作为佐剂,应用于口服狂犬病疫苗,并证明了其通过口腔免疫具有显著的体液免疫和细胞免疫增强作用。4.首次制备了可工业化生产的野生动物口服狂犬病疫苗,填补了我国野生动物狂犬病疫苗的空白。