目的:新生儿缺血缺氧性脑病（HIE）是新生儿期比较常见的合并症,由宫内窘迫,新生儿窒息,肺透明膜病等众多原因产生,是造成婴儿死亡和神经系统后遗症的主要因素。在早产儿中,HIE发病率高达60%。而其中,90%的发病患者患有长期神经系统功能障碍,包括神经系统发育迟缓,癫痫,学习认知功能障碍,运动功能障碍等。然而,现阶段对于HIE的治疗主要集中于急性期的对症治疗包括机械通气,降温,高压氧疗法以及损伤后的康复治疗等,其效果并不令人满意。我们仍十分需要一种能够逆转或减轻远期脑损伤的治疗手段。随着吸入麻醉药在婴幼儿手术中的广泛应用,麻醉药的脑保护作用受到关注。作为拥有多种药理功能的临床常用药物,吸入麻醉药如异氟醚和七氟醚,能够提高缺血脑组织对低氧的耐受性。七氟醚作为一种新生儿临床手术常用的吸入麻醉药,具有呼吸道刺激性小,麻醉深度易调节等优点。随着吸入麻醉药器官保护作用的深入研究,七氟醚的预处理和后处理都已被证实具有神经保护作用。然而由于HIE发病的不可预见性,后处理的临床意义相对更佳。已有研究表明,七氟醚后处理能够减少脑梗死容积,抑制神经细胞凋亡,促进海马神经元再生。课题组前期实验研究显示,在缺血缺氧模型中,七氟醚能够通过减少自噬的发生,抑制神经细胞的凋亡,从而起到神经保护作用。哺乳动物脑中持续存在神经发生的脑区一是侧脑室的室管膜下层（SVZ）,另一是海马齿状回（DG）的颗粒下层（SGZ）,因此出生后大鼠的脑中两个脑区大量存在神经干细胞,同时也是缺血缺氧时最脆弱区域。发育期脑损伤对皮质和海马区会产生严重的影响。在缺血缺氧发生后的急性期,神经干细胞受到外源性信号影响,向星形胶质细胞方向大量分化,分化而来的星形胶质细胞迁移向受损脑区进行急性期修复,形成胶质瘢痕。早期这被认为是一种应激性的神经系统自我保护作用。然而长期观察发现,随着星形胶质细胞增殖分化作用持续增强,修复过程中形成的胶质瘢痕会对缺血缺氧后神经元突触连接产生阻碍和屏障作用,影响正常神经元的排列结构。实验证明,在脑中风模型中,缺氧诱导因子（HIF-1α）参与调控成年大鼠SVZ区神经干细胞分化的方向,促进神经干细胞向神经元和神经母细胞方向分化,抑制向星形胶质细胞分化。HIF-1α是一种自然界中广泛存在的氧敏感转录因子,可控制数百个重要的氧稳态分子。尽管HIF-1α在神经元中常规存在,但在常氧条件下其表达非常低。在大多数细胞类型中,缺氧情况下HIF-1α蛋白稳定表达,但在常氧条件下会迅速降解。近来研究显示,HIF-1α的表达水平调节中,翻译后修饰在其中起到很大作用,尤其是其泛素化过程可调节其稳定性,从而改变HIF-1α的表达水平。蛋白泛素化过程由泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3参与。HIF-1α的特异性E3连接酶是pVHL。DJ-1（PARK7）是一种缺氧和氧化应激条件下的神经保护蛋白,可以通过抑制HIF-VHL间的相互反应降低HIF-1α的泛素化水平,DJ-1缺陷小鼠的氧化应激模型和中风模型中,HIF-1α的表达水平都有所降低。在帕金森病模型中,DJ-1表达水平的提高被证实抑制了 VHL活性的表达。综上,本课题首先探究七氟醚是否通过调节HIF-1α的表达,减轻缺血缺氧性脑损伤造成的胶质瘢痕,改善神经元排列结构,其次,探究七氟醚对HIF-1α表达水平的影响,是否与HIF-1α的泛素化进程相关,最后,探究七氟醚是否通过上调脑保护蛋白DJ-1,抑制HIF-1α泛素化水平,减轻胶质细胞过度增生及胶质瘢痕形成,改善新生大鼠缺血缺氧后远期学习与记忆功能,发挥脑保护作用。材料方法:1、实验动物:选取7天龄SPF级新生（Sprague-Dawley）SD大鼠,体重12～16g,由盛京医院本溪研发中心提供,恒温饲养,自由食水。本实验遵照国际伦理准则及国家卫生研究院实验室动物护理与使用指南进行,并经中国医科大学附属盛京医院医学伦理委员会审查批准（2016PS337K）。2、新生大鼠缺血缺氧性脑损伤模型（HIBI）制备:麻醉下进行7日龄新生SD大鼠左颈动脉结扎,放归母鼠身边哺乳休息恢复2小时后,放入37℃恒温水浴箱,通入8%O2,92%N2,,混合气体2小时。在行HIBI模型手术30分钟前,对7天SD新生大鼠左侧脑室注射HIF-1α抑制剂,其余组注射等量空白溶剂。3、造模12小时、24小时、48小时后采用Western blot法检测新生大鼠左侧海马缺氧诱导因子HIF-1α,泛素化E3连接酶VHL,脑保护蛋白DJ-1表达水平。采用Realtime PCR法检测新生大鼠左侧海马HIF-1α的mRNA表达水平。造模21天后采用旷场试验检测大鼠焦虑情绪、悬吊实验测试大鼠运动活性、Morris水迷宫实验检测学习记忆功能变化。4、尼氏染色计数左侧海马区神经元数量。Western blot法检测星形胶质细胞标志蛋白GFAP,神经元标记物NeuN和胶质瘢痕标志物Neurocan,突触形成相关蛋白PSD95,GAP43表达变化;高尔基染色观察神经元树突棘密度变化,免疫荧光双染法检测大鼠左侧海马,免疫荧光双染GFAP/Neun,GFAP/Neurocan表达变化。5、统计学分析:所有原始数据使用SPSS进行统计分析,以均数加减标准误表示。采用Shapiro-Wilk方法检验数据是否符合正态分布,使用单因素方差分析（one-way-anova analysis）然后进行Tukey事后检验。逃避潜伏期使用双因素方差分析（two-way-anova analysis）方法进行比较。p<0.05认为差异有统计学意义。结果:1、在第一部分实验中:尼氏染色结果显示,与假手术组（sham）相比,HI组海马区CA1,CA3,DG区神经元排列异常,细胞数目显著降低（p<0.05）,;高尔基染色结果显示,HI组海马CA1区树突棘密度降低,Western Blot结果显示,HI组突触形成相关蛋白降低,免疫荧光染色结果显示,HI组海马区胶质细胞增生肥大,胶质瘢痕增生,神经元排列结构异常,七氟醚处理后,大鼠学习记忆功能改善（与HI组相比,p<0.05）,神经元数目增加,树突棘密度升高,突触形成蛋白增高,胶质瘢痕减少,神经元排列结构改善。2、在第二部分实验中:新生大鼠行HI造模处理后21-25天,水迷宫检测结果显示,与Sham组相比,造模组从训练第二天开始,逃避潜伏期明显延长（p<0.05）;七氟醚处理组远期行为学和组化学结果均显著改善,给予HIF-1α抑制剂YC-1后,七氟醚的保护作用被逆转。新生大鼠在HI处理后12小时,24小时,48小时,缺氧诱导因子HIF-1α表达量逐渐降低;七氟醚后处理稳定了HIF-1α在脑内的持续表达。3、在第三部分实验中:real-timePCR结果显示,与HI组相比,七氟醚后处理组HIF-1α的mRNA水平表达无明显变化。新生大鼠在HI处理后12,24,48小时,HI组DJ-1表达降低,VHL表达水平升高,七氟醚处理后,DJ-1表达量上升,VHL的表达被抑制,HIF-1α表达稳定。结论:1.HI后新生大鼠海马区星形胶质细胞过度增生,形成胶质瘢痕,神经元排列结构受损,突触发生受到抑制,七氟醚后处理减轻星形胶质细胞过度增生及胶质瘢痕形成,发挥脑保护作用。2.七氟醚通过调节HIF-α水平减轻胶质瘢痕,保护神经元排列结构,促进突触发生,改善大鼠远期的学习记忆功能。3.七氟醚通过上调DJ-1,降低VHL表达,抑制HIF-1α泛素化进程进而影响星形胶质细胞、及神经元比例,行使脑保护作用。