论文部分内容阅读
目的:新生儿缺血缺氧性脑病(HIE)是指围产期窒息所致的新生儿脑损伤性疾病,伴有脑结构发育异常以及脑性瘫痪、癫痫及行为异常等后遗症,严重的威胁新生儿的生命健康。目前临床上使用的亚低温治疗以及氧疗等方法虽然对新生儿缺血缺氧性脑损伤有一定缓解作用,但远期治疗效果仍非常不乐观。寻找新型治疗方法减轻缺血缺氧性脑损伤,改善患儿远期预后仍迫在眉睫。诸多研究逐渐解释了新生儿缺血缺氧性脑病潜在的病理机制。缺血缺氧主要损伤大脑皮层,海马以及大脑室下区神经元。受损的神经元经历内环境稳态失衡,糖酵解ATP产能异常导致新生神经元能量代谢异常和凋亡、自噬、坏死、炎性等分子信号被过度激活导致的神经祖细胞程序化发育破坏甚至死亡。海马及海马环路作为大脑古皮质,在空间记忆力,学习能力以及情感调控中发挥重要作用。海马齿状回颗粒下层的新生神经元经历发生、迁移等过程最终将成熟神经元整合到现存的海马神经环路,对海马依赖性学习记忆功能尤其是新信息的储存,整理以及脑内信号传递处理有重要意义。目前研究发现,哺乳动物的大脑两个区域:海马和沿室壁的室下区(SVZ)侧脑室被认为是神经发生的重要部位。其中海马齿状回(DG)的祖细胞位于其颗粒下区域(SGZ)中。未成熟的海马神经元的神经发生与迁移在海马结构发育过程中逐渐成为密不可分的过程,且整个发生迁移过程极易受到外界环境刺激,许多有害刺激例如缺氧以及宫内发育受限等会对海马发育以及个体发育造成致命性损伤。实验研究证明全脑中风会过度诱发大脑神经再生,而对这些新生神经元进行追踪发现,过度增生的神经元最终发育为功能型细胞,整合到海马环路中的数量极少,甚至在分化为神经胶质细胞形成神经瘢痕,阻碍正常神经元的迁移,最终影响海马正常结构的形成。由诸多内在机制整合控制的海马发生迁移发育过程极易受到缺血缺氧等刺激影响,主要涉及神经发育调控因子NeuroD1,GDNF,CXCL12和以Reelin为代表的细胞外基质以及细胞间相互作用异常。由关键神经发生与迁移调控因子以及神经内在分子机制调控的正确的神经迁移发育过程对海马功能性回路的建立以及远期突触可塑性至关重要。近年来基于对大脑皮层Cajal-Retzius(CR)细胞发育以及其分泌的Reelin蛋白作用的研究逐渐揭示了海马神经迁移在中枢系统神经发育,神经元迁移,突触发生和海马依赖性远期学习记忆功能的重要作用。出生后,Reelin蛋白由脑内GABA能神经元持续分泌,其NPXY功能域进而与细胞膜表面受体ApoER2 and VLDLR结合,在SFK家族蛋白Src/Fyn激酶的激活下活化Dab1进一步激活Gsk-3β家族,最终作用于下游微管相关蛋白(MAP)影响神经元最终动态迁移过程。孕期缺氧刺激子代未成熟海马神经元Reelin蛋白变化的研究解释了Reelin蛋白介导的神经迁移紊乱与海马结构异常和远期行为认知障碍的潜在联系。近年来学者对于麻醉药对未成熟受损神经的保护作用展开了大量研究。七氟醚是新生儿手术中最常用的吸入性麻醉药,大量研究证实七氟醚预处理、后处理在大鼠缺血缺氧脑损伤中均具有显著保护作用。但以往的研究侧重于七氟醚通过抑制脑梗死体积,抑制神经细胞凋亡,抑制缺血再灌注后继发性炎症反应等减轻缺血缺氧脑损伤,而有关于七氟醚对缺血缺氧刺激下海马神经细胞发生与迁移的调控以及神经元排列重塑的作用研究鲜有报道。本课题首先探究缺血缺氧是否导致新生儿海马齿状回迁移发育异常、神经排列紊乱以及远期神经认知障碍,其次探究七氟醚后处理对缺血缺氧后神经迁移损伤以及远期行为认知障碍是否具有保护作用。最后探究七氟醚是否通过靶向调节神经迁移调控因子Reelin蛋白以及下游Reelin-Dab1通路,行使其修复受损后海马迁移发育异常,改善海马依赖性学习记忆功能的神经保护作用。研究方法:1.健康的SPF级SD新生七天大鼠,体重12-20g,由中国医科大学附属盛京医院本溪实验动物中心提供。饲养环境温度恒温24±2℃,相对湿度为50±10%且进食水自由。白昼黑夜更替12h:12h。七氟醚持续吸入麻醉新生7天SD大鼠,行左侧颈总动脉结扎手术。取仰卧位,安尔碘消毒皮肤后,做正中切口暴露左侧颈总动脉,用7-0丝线两次结扎动脉,缝合皮肤切口。术毕待其清醒后放回母鼠身边继续喂哺2h,然后将大鼠放入自制缺氧箱中(箱底部放有碱石灰吸收二氧化碳和湿气)并浸于36.5±5℃恒温水浴箱内。以2L/min流量向缺氧箱持续输入8%O2-92%N2的湿化混合气体2h来制备HIE模型。七氟醚后处理为HIE后立即吸入2.5%七氟醚(1.0MAC)30min。2.实验动物分组:将新生7天SD大鼠随机分组。第一部分实验中分为2组:(1)假手术组(Sham GROUP),(2)缺血缺氧组(HI Group),每组动物20只(n=20)。第二部分实验分为3组:(1)假手术组(Sham Group),(2)缺血缺氧组(HI Group),(3)缺血缺氧2.5%七氟醚后处理组(HI+Sev Group),每组动物25只(n=25)。第三部分实验分为4组:(1)假手术组(Sham Group),(2)缺血缺氧组(HI Group),(3)缺血缺氧2.5%七氟醚后处理组(HI+Sev Group)(4)缺血缺氧2.5%七氟醚后处理加Reelin降解酶抑制剂组(HI+Sev+G Group),每组动物35只(n=35)。3.各组新生大鼠生后第8,14,21天免疫荧光检测三个时间点内神经发生。生后第14,21天用免疫荧光检测神经迁移情况。生后第21天用尼氏染色观察DG区神经元排列方式以及神经元密度变化。生后第14,21天用免疫荧光检测Reelin表达情况。生后第14天用Western blot法检测左侧海马Reelin,Dab1,P-Dab1,Gsk-3β,P-Gsk-3β,total Tau,,P-Tau蛋白表达量。生后28到35天进行旷场、水迷宫和八臂迷宫实验检测大鼠神经行为学变化。结果:第一部分实验结果:生后8,14天,21天进行的免疫荧光结果显示,与Sham组相比,第8天海马齿状回神经发生显著增加(p<0.05),而在第14天和21天检测时间点我们发现,HI组神经发生能力与Sham组无明显差异。HI组生后14天,21天进行的免疫荧光结果显示,海马齿状回新生神经元迁移阻滞于齿状回颗粒下层现象,迁移过程出现明显异常(p<0.05),生后21天进行尼氏染色结果显示神经元排列杂乱且密度显著降低(p<0.05)。远期学习记忆功能检测结果显示,与Sham组相比,HI组从训练第二天开始,逃避潜伏期明显延长(p<0.05)且第六天穿越平台象限结果显示,HI组穿越平台象限次数明显降低(p<0.001)。第二部分实验结果:生后8,14天,21天进行的免疫荧光结果显示,与HI组相比,第8天HI+Sev组大鼠海马齿状回神经发生情况显著降低(p<0.05),而在第14天和21天检测时间点各组之间神经发生能力无明显差异。生后14天,21天进行的免疫荧光结果显示,与Sham组相比HI+Sev组大鼠海马齿状回神经迁移阻滞现象得到显著缓解(p<0.05),神经元生存比例以及神经元排列基本结构得到恢复(p<0.05)。水迷宫结果显示,七氟醚后处理能显著缩短潜伏期且增加穿越平台象限次数(p<0.05)。免疫荧光检测结果显示,大鼠生后第14,21天,HI组海马齿状回Reelin蛋白持续高表达(p<0.05)。七氟醚后处理能显著降低Reelin蛋白的持续性高表达(p<0.05)。第三部分实验结果:生后8,14天,21天进行的免疫荧光结果显示,与Sham组相比,第8天HI组大鼠海马齿状回神经发生情况显著增加(p<0.05),七氟醚后处理能显著降低过度增殖的新生神经元(p<0.05)。而应用Piceatannol对神经发生无明显作用。在第14天和21天检测时间点各组之间神经发生能力无明显差异。七氟醚后处理加生后14天,21天进行的免疫荧光结果显示,与Sham组相比,HI组大鼠海马齿状回神经迁移受到阻滞,神经元生存比例以及神经元排列基本结构异常(p<0.05)。与HI组相比,七氟醚后处理能恢复以上损伤(p<0.05)。而在HI+Sev+G组中,七氟醚作用被逆转(p<0.05)。Western-blot结果显示,与Sham组相比,HI组中Reelin、活化的Dab1(P-Dab1)、活化的GSK-3β(P-GSK-3β)和磷酸化微管相关蛋白Tau水平显著升高(p<0.05).七氟醚后处理组能显著抑制被HI激活的Reelin/Dab1/GSK-3β/Tau通路(p<0.05)。与HI+Sev组相比,HI+Sev+G组能阻断七氟醚后处理的作用(p<0.05)。水迷宫实验结果显示,与Sham组相比,HI组从训练第二天开始,逃避潜伏期明显延长(p<0.05)且穿越平台象限次数明显降低(p<0.05)。七氟醚后处理能显著缩短潜伏期且增加穿越平台象限次数(p<0.05).应用Piceatannol能逆转七氟醚的作用。八臂迷宫结果显示,与Sham组相比,HI组大鼠运动总距离和参考记忆错误显著增加(p<0.05),七氟醚后处理能显著降低HI组大鼠运动总距离和参考记忆错误(p<0.05)。应用Piceatannol后七氟醚的作用被逆转。结论:缺血缺氧后,大鼠海马齿状回神经迁移阻滞,24小时后神经元反应性增殖,远期神经元排列杂乱且成年后空间记忆学习能力受损。七氟醚后处理靶向性调节Reelin蛋白表达,抑制被缺血缺氧刺激激活的Reelin/Dab1信号通路,改善海马齿状回神经元迁移阻滞现象,恢复受损的海马结构并缓解大鼠远期空间学习记忆障碍。