【摘 要】
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背景:大气细颗粒物（PM2.5）污染导致的人体健康危害近年来引起广泛关注,当前对于大气细颗粒物暴露与健康的研究已经从呼吸系统拓展到全身多器官、多系统的损害。人体视觉系统中的眼球作为机体与外界环境直接接触器官,其健康损伤也引起了公共卫生领域的关注。现有对于PM2.5暴露与角膜之间的研究发现,暴露于PM2.5后的角膜会出现炎症因子分泌增多、角膜上皮伤口愈合缓慢、角膜上皮细胞衰老加速等现象。近年来,大量
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背景:大气细颗粒物（PM2.5）污染导致的人体健康危害近年来引起广泛关注,当前对于大气细颗粒物暴露与健康的研究已经从呼吸系统拓展到全身多器官、多系统的损害。人体视觉系统中的眼球作为机体与外界环境直接接触器官,其健康损伤也引起了公共卫生领域的关注。现有对于PM2.5暴露与角膜之间的研究发现,暴露于PM2.5后的角膜会出现炎症因子分泌增多、角膜上皮伤口愈合缓慢、角膜上皮细胞衰老加速等现象。近年来,大量临床和实验研究表明,角膜上皮屏障功能异常是许多眼部疾病的病理基础,但是关于PM2.5是否会破坏角膜上皮层屏障功能以及相关通路的机制研究仍需要进一步探索。目的:探讨真实环境中的PM2.5对角膜上皮层的影响及PM2.5通过Wnt/β-catenin信号通路导致角膜上皮层屏障功能损伤的机制研究,进而对角膜上皮层产生的损伤提供毒理学数据。方法:在石家庄将80只5-7周龄C57BL/6N小鼠按体重随机分为对照组、暴露组,每组雌雄各半。将小鼠饲养在独立通风笼（IVC）系统中,该系统可补偿因气管滴注、暴露小鼠生命活动受限、笼内负压变化等产生的影响。分别将小鼠暴露4周和8周后,进行眼球的摘取,一部分于-80°C冰箱冻存备用,用于电镜观察角膜组织的超微结构。另一部分保存于4%多聚甲醛中,用于眼球组织的病理学检查,观察角膜组织的结构变化。解冻小鼠眼球组织,液氮研磨成粉末,Trizol法提取小鼠眼球组织总m RNA,实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR）和免疫印迹法（Western Blot）检测小鼠眼球组织中的Wnt-3a和β-catenin等Wnt通路中的相关基因以及蛋白表达;采用免疫荧光染色（Immunofluorescence,IF）检测角膜组织和人角膜上皮细胞（HCEC）中与屏障功能相关的紧密连接蛋白（ZO-1）和粘连蛋白（E-cadherin）的蛋白表达情况;采用跨膜电阻实验（TEER）检测人角膜上皮细胞的电阻值变化情况。结果:1.连续暴露PM2.5颗粒物4周和8周后,小鼠角膜上皮层出现明显的病理变化,4周和8周PM组小鼠角膜上皮层出现细胞排列紊乱现象。2.扫描电子显微镜结果发现,FA（过滤空气）组角膜上皮细胞表面存在大量微绒毛,并且上皮层中各层之间连接紧密,但在角膜暴露PM2.5的8周组中发现,细胞表面微绒毛大量消失并且上皮层细胞层之间出现了明显的连接断裂现象。3.免疫荧光染色观察到4周和8周的PM组中与屏障功能相关的紧密连接蛋白（ZO-1）和钙粘蛋白（E-cadherin）的荧光强度显著低于FA组（P＜0.05）。4.实时荧光定量PCR实验和免疫印迹法分析观察到4周的典型Wnt通路相关的Wnt-3a以及β-catenin基因表达上调（P＜0.05）以及蛋白表达增加（P＜0.05）,说明暴露于PM2.5过程中典型Wnt通路被激活。5.将细胞在含PM2.5的培养基中处理24小时,每间隔3小时进行跨膜电阻值的测量,发现跨膜电阻值呈剂量依赖性降低。6.细胞免疫荧光实验发现将细胞暴露PM2.5 24小时后,HCECs细胞内的ZO-1和E-cadherin荧光强度明显低于对照组;β-catenin荧光强度显著高于对照组（P＜0.05）。加入Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂IWR-1 endo后发现,E-cadherin荧光强度明显上调,并与PM2.5组相比有明显差异（P＜0.05）,同时β-catenin的荧光强度明显下调,与PM2.5组相比有明显差异（P＜0.05）,证明在PM2.5暴露过程中Wnt/β-catenin信号通路的激活导致了角膜上皮屏障功能的损伤。结论:角膜在暴露于PM2.5后会通过激活Wnt/β-catenin信号通路,导致β-catenin表达上升,破坏了β-catenin与E-cadherin复合物,进而E-cadherin表达降低损伤角膜上皮屏障功能。Wnt/β-catenin信号通路抑制剂IWR-1 endo的加入导致E-cadherin蛋白表达量上调,证明在PM2.5暴露过程中Wnt/β-catenin信号通路激活导致了角膜上皮屏障功能的损伤。本研究为真实环境中大气颗粒物对于角膜上皮造成的屏障功能损伤提供研究基础。
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