奉节脐橙(Citrus sinensis Osbeck)是一种优良的甜橙鲜食品种,是重庆市柑橘出口中唯一具有较强竞争优势的品种。但是,其果皮容易发生褐变,主要症状为油胞破裂下陷、形成褐斑,极大地影响了果实的感官品质和商品价值。目前,对脐橙果皮褐变的诱发因素已有大量研究,但在分子机理研究方面尚十分缺乏。在本实验室前期工作中运用抑制差减杂交方法构建了脐橙果皮褐变相关基因的cDNA差减文库。经序列分析表明,该文库中包括了蛋白质加工、能量代谢、转录调控、胁迫反应等生化代谢途径的相关基因。为了深入阐明果皮褐变相关基因对果皮褐变发生的作用,本研究从脐橙果皮褐变差减文库中选择了两个感兴趣的EST序列7号和27号,分别为与衰老相关的半胱氨酸蛋白酶同源基因和与胁迫相关的NAC转录因子同源基因。通过RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术克隆得到其未知的5’端或3’端区域,从而获得全长cDNA序列。7号克隆全长cDNA序列为1409 bp,命名为CsCP,GenBank登录号EF690284。CsCP包含一个1083 bp的开放阅读框(ORF),编码361个氨基酸,预测的蛋白质分子量为39.38 kDa,等电点为6.69。其中1-23位氨基酸残基为信号肽,该蛋白质定位在内质网上。CsCP蛋白与aleurain半胱氨酸蛋白酶的同源性高达80%以上。27号克隆全长cDNA序列为1203 bp,命名为CsNAC,GenBank登录号EF596736。CsNAC包含一个915 bp的开放阅读框(ORF),编码305个氨基酸,预测的蛋白质分子量为35.2 kDa,等电点为6.72。CsNAC蛋白具有高度保守N端和高度可变的C端,与拟南芥中的ATAF1蛋白的同源性为63%,同属于NAC结构域蛋白ATAF家族。运用荧光定量PCR SYBR Green I染料法分析了CsCP和CsNAC基因在果皮褐变发生进程和不同组织中的表达模式。结果表明,伴随果皮褐变指数的上升,CsCP基因的表达增强。由于柑橘果皮褐变也是一个衰老的过程,因此CsCP是一个与果皮褐变及衰老相关的基因,在果皮褐变过程中受上调表达。CsNAC基因在柑橘果皮发生褐变的进程中,其表达水平比在正常果皮中高,说明它也是一个褐变相关基因,可能在褐变的整个发展进程中发挥着重要作用。Northern杂交结果表明,CsCP基因受低氧3% O2和高温40℃诱导表达,而受损伤、乙烯处理和无氧0% O2抑制表达。说明CsCP是一个与胁迫反应相关的基因,而且它是目前发现的第一个从柑橘中分离的受乙烯抑制表达的半胱氨酸蛋白酶基因。CsNAC基因的表达水平受损伤和无氧强烈诱导,而不受低氧影响,说明CsNAC不仅是一个损伤诱导基因,而且也是一个无氧相关基因,可能在非生物胁迫条件引起的果皮褐变过程中扮演重要角色。此外,CsNAC也受到外源乙烯的诱导表达,说明它可能是乙烯信号途经中的一个下游反应元件。本研究在脐橙果皮褐变抑制差减文库基础上,分离得到两个果皮褐变相关基因的全长cDNA序列,并分析了它们在果皮褐变进程和不同组织中的表达模式,以及在非生物胁迫条件处理后的表达水平变化,为阐明果皮褐变的分子机理提供了重要的理论依据。