研究背景膀胱癌是泌尿系统最常见肿瘤之一。在全球范围内,膀胱癌发病率居恶性肿瘤的第九位。而在过去的六七十年中,全世界膀胱癌发病率也逐年升高,尤其是在发展中国家。在我国,膀胱癌发病率也呈逐年增高趋势。90%以上膀胱癌是尿路上皮癌,其中有70%以上为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC).目前经尿道膀胱肿瘤切除术(TURBt)加术后灌注治疗为治疗NMIBC的金标准。尽管术后膀胱灌注化疗可以降低患者术后肿瘤复发率,但是总体复发率仍旧偏高。肿瘤的化疗抵抗和耐药是其中一个重要的原因。除了复发率高,NMIBC另外一个特征就是70%以上的肿瘤存在成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growth factor receptor3, FGFR3)突变。而PI3K/Akt通路是FGFR3下游主要信号通路,该信号通路在细胞增殖、存活、凋亡、糖代谢、核糖体功能、基因转录和细胞迁移中扮演了重要的角色,被公认为具有很强的促进细胞生长和抗凋亡能力,很多研究认为它是肿瘤化疗抵抗的一个重要原因。Akt是PI3K/Akt通路的中枢分子。突变的FGFR3可以使下游的PI3K/Akt信号通路在NMIBC中表现较为活跃,并且使得肿瘤生长能力加强,对细胞毒性药物的刺激也能更加耐受,从而导致肿瘤复发甚至进展。目前关于PBK/Akt通路在NMIBC中的研究并不多,有些甚至还存在争议。因此在NMIBC中研究PI3K/Akt通路尤其是Akt的表达和激活水平对了解NMIBC的化疗耐药和复发有着重要的意义。第一部分,pAkt表达水平与NMIBC患者无复发生存率关系研究1.1.研究目的研究Akt在NMIBC中的表达情况,并同时研究Akt激活状态与NMIBC患者术后无复发生存率之间的关系,以明确Akt表达上调是否是肿瘤复发的重要因素。1.2.实验方法通过免疫组化的方法,检测了89例初发NMIBC患者肿瘤组织中磷酸化Akt(pAkt)的表达水平,结合患者临床资料,比较了pAkt表达水平与患者年龄、性别、肿瘤分级、肿瘤分期、肿瘤大小和数量的关系,并且进一步通过Kaplan-Meier生存分析了解这些指标与患者肿瘤无复发生存率(RFS)的联系,并且用COX回归方法分析了各个风险因素的独立性。1.3.实验结果pAkt在NMIBC中阳性率为73.0%(65/89),高表达率为22.5%(20/89)；在正常组织中的阳性率为20.0%(1/5),高表达率0%。pAkt在肿瘤中的阳性率明显高于正常组织(p<0.01)。pAkt表达水平与患者年龄、性别以及肿瘤分期、分级、数量和大小等临床指标均无明显关联。用Kaplan-Meier生存分析研究了各临床指标与患者RFS的关系,结果表明只有pAkt高表达水平、肿瘤直径大于3cm和肿瘤高分级这3个因素与患者无复发生存时间缩短相关。而进一步通过COX回归分析,发现只有pAkt高表达水平是独立的危险因素,其KR值为0.28。1.4.实验结论pAkt在NMIBC肿瘤中阳性率和高表达率均较高,并且pAkt的表达水平是一个可以独立预测NMIBC患者TURBt术后RFS的危险因素。第二部分,喜树碱处理NMIBC后Akt表达水平变化研究2.1.研究目的研究常用灌注化疗药物喜树碱(CPT)在NMIBC细胞和人体组织中对Akt和pAkt表达水平的影响。2.2.实验方法研究对象为对CPT敏感的RT4细胞和对CPT相对不敏感的5637细胞,同时我们构建了耐CPT的RT4/CPT细胞。首先用CCK-8检测了三种细胞对CPT的敏感性,此后用水溶性的HCPT模拟膀胱灌注来处理这些细胞后,观察Akt和pAkt蛋白水平变化情况。此外还从18例配对的初发和早期复发的NMIBC患者的肿瘤标本中,用免疫组化检测了Akt和pAkt表达情况。这些患者术后都行CPT灌注化疗,通过比较Akt和pAkt表达水平在初发和复发中的前后变化,进一步了解Akt对CPT耐药的机制和Akt在肿瘤复发中的地位和作用。2.3.实验结果RT4、5637和RT4/CPT细胞对CPT的敏感性实验通过CCK-8检测提示3种细胞活力均随时间增长而减少。RT4细胞对CPT最为敏感,到12h便已接近半数活力；5637细胞较为耐药,到48h只下降到半数活力；RT4/CPT细胞最为耐药,到48h仍有75%左右活力,RT4/CPT细胞中Akt和pAkt的表达水平均高于在RT4细胞,提示RT4细胞在克服CPT的细胞毒性产生耐药的过程中,Akt起了重要的作用。5637细胞pAkt水平也高于RT4细胞,提示pAkt水平高低是影响膀胱肿瘤细胞对CPT的敏感性的一个重要因素。RT4、RT4/CPT和5637细胞经HCPT处理后,pAkt水平均明显上调,分别在处理后2h、8h和10h达到高峰。在配对的NMIBC肿瘤标本中,Akt和pAkt表达水平在复发肿瘤中都明显高于相对应的初发肿瘤。2.4.实验结论膀胱肿瘤细胞中pAkt高水平与CPT敏感性差相关。CPT可以上调膀胱肿瘤细胞和NMIBC患者复发肿瘤中的Akt和pAkt水平。第三部分,P13K抑制剂和DNA-PK抑制剂影响膀胱肿瘤对CPT敏感性的体外研究3.1.研究目的研究阻断Akt的激活以及阻断细胞修复CPT引起的DNA损伤所需要的激酶DNA-PK是否可以增加膀胱肿瘤对CPT的敏感性。3.2.实验方法应用P13K抑制剂wortmannin阻断Akt活性,用流式细胞方法比较CPT和wortmannin单用或联用诱导RT4/CPT和5637细胞的凋亡情况。实验同时还在正常移行上皮细胞SV-HUC-1中检测了wortmannin和CPT协同效应的安全性。此外,由于CPT作用机理主要是引起细胞DNA损伤,因此本课题还同时研究了阻断细胞损伤修复必须的DNA-PK激酶活性后,RT4/CPT、5637和SV-HUC-1细胞对CPT的敏感性变化。课题选择了DNA-PK抑制剂Nu7441来阻断DNA-PK活性。3.3.实验结果流式细胞凋亡实验结果显示：在RT4/CPT细胞中,单用CPT、wortmannin釉Nu7441无法诱导凋亡,wortmannin和CPT联用可以显著增力RT4/CPT细胞对CPT的敏感性,凋亡率高达37.8%的(CPT40μM),而Nu7441和CPT联用也无法促进凋亡。在5637细胞中,单用CPT的杀伤作用相对明显,随剂量增加而增加,CPT10μM、20μM和40-tM总凋亡率分别约为15%,24%和27%,单用wortmannin和Nu7441无法诱导凋亡；Wortmannin和CPT联用显著增加5637细胞对CPT的敏感性,凋亡率高达51.3%(CPT40μM); Nu7441和CPT联用凋亡率35.4%(CPT40μM).在SV-HUC-1细胞中,单用CPT、wortmannin和Nu7441均无法诱导凋亡；wortmannin和CPT联用可以显著增加SV-HUC-1细胞对CPT (40μM)的敏感性,总凋亡率上升到14.6%；Nu7441和CPT联用没有此效果。3.4.实验结论NMIBC细胞应对CPT引起的损伤主要通过PI3K/Akt通路的激活来抵抗凋亡使存活得以继续,而不是通过DNA-PK介导的DNA损伤修复。P13K抑制剂与CPT联用在NMIBC细胞中有明显的协同效应,并且在正常的移行上皮细胞中也有一定的安全性。