研究背景结核病是可侵犯全身组织器官的慢性传染病，尤其以肺部感染多见，病原体为结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）。随着卡介苗的普遍接种及抗结核药物的应用，结核病的感染率、发病率和死亡率曾大幅下降。近年来，由于人口流动增多、耐药菌株的流行、结核菌与人体免疫缺陷病毒（HIV）的双重感染以及许多国家结核病控制力度的薄弱，导致全球结核病疫情回升。机体的抵抗力，侵入机体的细菌数量，细菌毒力的大小，共同决定了感染者是否发病。结核分枝杆菌属胞内感染菌，机体的抗结核免疫主要依靠T淋巴细胞，特别是以CD4~+Thl细胞为主的细胞免疫。机体感染结核分枝杆菌后，抗原递呈细胞（antigenpresent cells，APCs），主要是单核巨噬细胞对其吞噬，加工处理，抗原肽结合APCs表面的人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA），形成多肽／HLA复合物，然后被T淋巴细胞表面的T细胞受体（T-lymphocyte receptor,TCR）特异性地识别并结合，进而介导一系列的免疫反应。利用多肽/MHC与TCR的特异性结合的特性，许多学者考虑采用免疫标记技术标记多肽/MHC去检测表达有TCR分子的多肽特异性T淋巴细胞。但由于多肽/MHC单体与CD4~+T淋巴细胞的TCR结合亲和力低，解离速度很快，不能直接用来检测抗原特异性T淋巴细胞。1996年，Altman等成功创建了多肽/MHC四聚体技术，从而大大提高了多肽/MHC复合物与TCR的亲和力和稳定性，使这一难题得到解决。目前，多肽／MHC I四聚体己被广泛用于抗原特异性CTL活性检测，而且可应用于免疫学研究和检测、免疫治疗以及疫苗疗效监测。传统制备MHCI类分子四聚体是用基因工程的方法，先分别制备β2m和可生物素化的重链（通过在其C端加上15个氨基酸的BirA酶底物肽），然后二者和特异性抗原肽共同孵育，形成MHC-肽复合物单体。经过BirA酶作用后，生物素化的MHC-肽复合物单体与链霉亲和素按4：l的比例结合，形成MHCⅠ-肽四聚体。然而，MHCⅡ类分子（DR）是由α链和β链形成的异二聚体，由于α、β两条链都具有多态性，体外折叠时通常不能很好的结合短肽，因此，制备MHCⅡ类分子的四聚体要复杂得多。根据Novak的研究，在α、β链的C端连上连接蛋白和亮氨酸拉链基序，且β链上加上可生物素化的底物肽。经大量表达、分离纯化和生物素化后，在体外与高浓度的特异性多肽37℃孵育72小时，形成多肽/MHCⅡ-肽复合物，最后与荧光素标记的链霉亲和素结合形成四聚体。在实验室前期，已构建了16株能分泌表达不同C5/HLA-DRB1单体的果蝇S2恒定细胞株，本次实验研究应用了其中2株（C5/HLA-DRB1*090102和C5/HLA-DRB1*130201）。C5是来源于CFP10中的一段氨基酸序列，本实验室之前的研究通过用ELISPOT等方法已经证实了C5是一种广谱HLA-DR限制性的CD4~+T淋巴细胞反应性多肽。而HLA-DRB1*090102和HLA-DRB1*130201为HLA-DRB1基因座的两种不同等位基因序列，分别编码不同的HLA-DRB1分子。研究目的1.应用已制备的四聚体，结合激光共聚交显微镜在结核组织中观察C5特异性CD4~+T淋巴细胞。2.应用已制备的四聚体，结合流式细胞技术检测C5特异性CD4~+T淋巴细胞在结核患者外周血单个核细胞中的比例。研究内容和方法应用已有的果蝇S2恒定细胞株，分别表达、纯化获得2种生物素化C5/HLA-DRB1（C5/HLA-DRB1*090102和C5/HLA-DRB1*130201）复合物单体，通过SDS-PAGE和Dot blot进行鉴定，证实为目的单体蛋白后，制备FITC标记的四聚体，分别与鼠抗人CD4共染色，对肺结核患者的肺组织切片进行原位染色，用激光共聚焦显微镜观察C5特异性四聚体阳性CD4~+T淋巴细胞的分布，以肺炎组织切片作对照染色；制备成相应PE标记的四聚体，分别与抗人CD4-FITC共染色，流式细胞技术分析检测肺结核患者外周血C5特异性CD4~+T淋巴细胞，同时以健康成人及非结核呼吸道感染患者外周血作为研究对照，然后采用SSPS16.0统计软件进行Wilcoxon秩和检验。结果1.本实验通过诱导可分泌表达生物素化的C5／HLA-DRB1复合物单体的细胞株，经纯化、浓缩得到C5／HLA-DRB1复合物单体蛋白。经过SDS-PAGE鉴定两种单体蛋白与目的蛋白的分子量大小一致，Dot blot鉴定证实两种单体蛋白均为生物素化的αβ链的二聚体。2种C5／HLA-DRB1四聚体：l3号：C5／HLA-DRB1*090102、14号：C5／HLA-DRB1*130201均为目的蛋白单体。2.应用2种四聚体用原位染色来检测病理组织切片，可直接观察到组织中针对C5特异性CD4~+T淋巴细胞的比例、在组织中的定位及分布情况。观察整个肺结核病变组织切片后均能发现C5特异性CD4~+T淋巴细胞，而肺炎病理切片对照中，未发现C5特异性CD4~+T淋巴细胞。3.应用C5/HLA-DRB1*090102四聚体检测肺结核组、非结核呼吸道感染组和健康成人组的C5特异性CD4~+T淋巴细胞的中位数分别为0.15%、0.09%、0.03%，而应用C5/HLA-DRB1*130201四聚体则分别为0.19%、0.10%、0.04%，肺结核患者组外周血C5特异性CD4~+T淋巴细胞的中位数高于对照组（p﹤0.05），2种四聚体之间的检测结果无显著性差别（p﹥0.05）。结论1．诱导果蝇S2恒定细胞株表达、纯化、浓缩后的蛋白经Dot blot和SDS-PAGE鉴定，证实已制备蛋白为目的蛋白。2．采用四聚体技术观察到肺结核患者的病变组织存在C5特异性CD4~+T淋巴细胞。该技术可应用于结核病变组织结核特异性T细胞的检测。3．采用四聚体技术发现肺结核患者C5特异性CD4~+T淋巴细胞的比例普遍高于非结核患者和健康人。