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研究目的:多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是最常见的一类恶性浆细胞肿瘤,由于单克隆浆细胞恶性增殖、广泛浸润并分泌大量单克隆免疫球蛋白（M蛋白）从而引起广泛骨质破坏、感染、贫血、高钙血症及肾功能不全。近年来,随着新药的临床应用以及自体干细胞移植的广泛开展对初诊及难治复发患者的缓解率及无病生存期得到明显改善。然而,MM仍然是一种无法治愈的疾病。因此,需要我们进一步探索MM的发生、发展的分子机制,寻找到更新、更有效的诊断和治疗靶点提供重要的生物学依据。PIWI蛋白互作RNA（PIWI interacting RNA,pi RNA）是一类新发现的nc RNA,长度为21-35 nt。它通常与Argonaute蛋白的PIWI亚家族结合发挥作用并与生殖系发育中的转座子沉默有关。尽管过去的研究认为pi RNA仅在性腺细胞中起作用,但最近的研究表明,pi RNA在多种肿瘤中存在差异表达,并有效的控制不同类型肿瘤的生物学功能,如肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和分化,可能成为肿瘤的潜在生物标志物。在多发性骨髓瘤方面,关于pi RNA的作用机制研究很少,目前仅有一个pi RNA,pi RNA-823,研究发现pi RNA-823在骨髓瘤细胞中呈高表达,并通过影响骨髓微环境进而参与骨髓瘤细胞的生存。因此,本研究探讨PIWI蛋白互作RNA-004800（PIWI-interacting RNA-004800,pi R-004800）在MM患者及正常人中的表达差异及临床意义,研究其在MM细胞中的生物学功能并进一步探讨其相关分子生物学机制。研究方法:第一部分:筛选多发性骨髓瘤患者和正常人骨髓上清液外泌体中差异表达的pi RNA1.收集3例MM患者及3例正常人骨髓上清液,提取外泌体,应用二代基因测序技术筛选差异表达的pi RNA。2.大样本验证:收集66例MM患者、17例正常人骨髓上清液及细胞培养上清液中的外泌体,提取RNA,应用RT-PCR检测差异表达的pi RNAs,验证其表达趋势是否与测序结果一致。提取33例MM患者的CD138+浆细胞、18例正常人单个核细胞及MM细胞系（RPMI8226,U266）中的RNA,应用q RT-PCR检测细胞中pi RNA的表达水平,进一步验证。3.根据测序及验证结果,本课题选取pi R-004800进行进一步研究。收集MM患者临床信息,明确pi R-004800的表达水平与ISS临床分期的关系。第二部分:探讨pi R-004800在MM细胞系（RPMI8226和U266）中的表达对细胞增殖、凋亡及自噬的影响1.应用antagomir/agomir瞬时转染MM细胞系RPMI8226和U266,沉默或过表达pi R-004800。2.将MM细胞分为实验组（antagomir-4800/agomir-4800转染细胞组）、对照组（antagomir/agomir-NC转染细胞组）及空白对照组（未转染组）,使用MTS法对三组细胞的增殖能力进行检测。流式细胞术检测三组细胞的凋亡水平。Western blot检测转染后细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-XL、BAD、cleaved PARP、cleaved caspase-3、Mcl-1、total caspase-3和Stat3的表达水平。Western blot检测转染后细胞中自噬标志性蛋白LC3B、p62及becline1的表达,明确MM细胞的自噬水平。3.建立裸鼠皮下MM成瘤治疗型模型,通过体内实验明确pi R-004800对MM细胞增殖、凋亡和自噬的作用。第三部分:pi R-004800在MM细胞中作用的调节机制研究1.使用S1P受体信号通路激动剂及抑制剂S1P和FTY720分别处理RPMI8226和U266细胞,使用q RT-PCR法检测pi R-004800的表达。2.运用si RNA下调S1P受体下游CDC42在MM细胞系中的表达,RT-PCR检测CDC42敲减效率及pi R-004800的表达。3.使用antagomir-4800或antagomir-NC沉默MM细胞pi R-004800后,Western blot检测p-Akt、Akt、m TOR及p-m TOR的表达。4.使用S1P处理antagomir-4800或antagomir-NC转染后的MM细胞,Western blot检测p-Akt、Akt、m TOR及p-m TOR的表达。研究结果:第一部分:多发性骨髓瘤患者和正常人中差异表达的pi RNA筛选结果1.MM患者及正常人外泌体小RNA测序筛选出1521个表达上调的pi RNAs,表达下调的pi RNAs有498个（Fold Change≥2.0,p-value<0.05）。2.在筛选结果中选取表达上调差异最明显的4个pi RNAs（novel-pi R15,pi R-004800,novel-pi R334,pi R-016659）,扩大样本量验证,RT-PCR结果显示pi R-004800在患者骨髓上清液外泌体、原代CD138+浆细胞、MM细胞系及其培养液外泌体中表达上调。3.将MM患者按国际分期系统（International Staging System,ISS）分为三组:ISSⅠ、ISSⅡ和ISSⅢ。在ISSⅡ和ISSⅢ期MM患者,其pi R-004800的表达水平明显高于正常对照组及ISSⅠ组（p﹤0.01）,提示pi R-004800的表达水平与MM的临床分期呈正相关。第二部分:pi R-004800在MM细胞系增殖、凋亡及自噬中发挥重要作用。1.制备antagomir/agomir-4800和antagomir/agomir-NC,转染antagomir-4800可下调MM细胞中pi R-004800表达（p<0.01）,转染agomir-4800可使MM细胞中pi R-004800表达明显上调（p<0.01）。2.与对照组和空白对照组相比,antagomir-4800组细胞的增值能力明显降低（p﹤0.01）,agomir-4800组细胞的增殖能力明显增高（p﹤0.01）。3.流式细胞术的检测结果显示,相比对照组,antagomir-4800组细胞早期凋亡率明显增加（p﹤0.05）。4.Western blot结果显示,与对照组相比,antagomir-4800组MM细胞中总caspase-3和凋亡抑制蛋白Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1表达下调,促凋亡蛋白BAD、cleaved PARP和cleaved caspase-3表达上调。5.Western blot结果显示,与对照组相比,antagomir-4800组MM细胞中自噬标志性蛋白LC3B-Ⅱ表达上调,p62表达下调,提示下调pi R-004800可以激活MM细胞发生自噬。敲减pi R-004800后,使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3MA）或Bafilomycin A1处理MM细胞,MTS结果显示自噬抑制剂可以挽救pi R-004800敲低诱导的细胞死亡。6.动物实验显示,antagomir-4800组小鼠的皮下肿瘤生长被显着抑制。在肿瘤组织上进行体外实验相应指标的免疫组织化学染色和蛋白质印迹检测。结果与体外实验一致。第三部分:S1P受体信号通路可通过pi R-004800调节MM细胞中PI3K/Akt/m TOR信号通路。1.MM细胞系经FTY720处理后pi R-004800的表达明显降低（P﹤0.05）。S1P处理后,pi RNA-004800的表达明显增加（p﹤0.01）。CDC42敲低后,MM细胞系中pi R-004800的表达明显降低（p﹤0.01）。2.相对于对照组,antagomir-4800组MM细胞中p-Akt、Akt、m TOR及p-m TOR的表达明显下降（p﹤0.01）。3.下调MM细胞系的pi R-004800表达后,使用S1P处理MM细胞,MM细胞中Akt、p-Akt、m TOR和p-m TOR的表达可以部分恢复。研究结论:1.pi R-004800在MM患者及细胞系样本中的表达明显高于正常人,其表达水平与MM患者的ISS分期呈正相关。2.pi R-004800具有促进MM细胞增殖的作用,其下调后能够在体内外抑制MM细胞增殖,促进MM细胞凋亡,同时可诱导细胞产生自噬性死亡。3.S1PR信号通路可调节pi R-004800的表达,pi R-004800可进一步通过调节PI3K/Akt/m TOR信号通路影响MM细胞生存。