【摘 要】
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脑桥小脑发育不良（Pontocerebellar hypoplasias,PCH）是一种罕见的遗传性神经退行性疾病,临床症状表现为严重的认知障碍,运动障碍以及癫痫发作。神经放射学和神经病理学特征将PCH分为19个亚型,其共同特征为腹桥、下橄榄和小脑的进行性变性。目前已鉴定出16个与PCH相关的基因,包括VRK1、EXOSC3、TSEN54、TSEN2、TSEN34、SEPSECS、RARS2、CH
【基金项目】
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辽宁省产科疾病临床医学研究中心及协同网络建设（2016007014）；
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脑桥小脑发育不良（Pontocerebellar hypoplasias,PCH）是一种罕见的遗传性神经退行性疾病,临床症状表现为严重的认知障碍,运动障碍以及癫痫发作。神经放射学和神经病理学特征将PCH分为19个亚型,其共同特征为腹桥、下橄榄和小脑的进行性变性。目前已鉴定出16个与PCH相关的基因,包括VRK1、EXOSC3、TSEN54、TSEN2、TSEN34、SEPSECS、RARS2、CHMP1A等。其中TSEN2是PCH2B的致病基因。PCH2B是PCH最常见的一个类型,典型的临床特征为出生时呼吸和进食困难、运动障碍、认知和运动发育严重障碍、进行性小头畸形、婴儿期晚期或幼儿早期夭折。PCH2B的MRI表现为脑干和小脑发育不全,小脑半球比蚓部受影响更大。在约40%的PCH2患者中,大脑皮层显示轻度或重度脑萎缩。在前期工作中,我们收集到了1个PCH2B家系,先证者临床表现为小头畸形伴小脑脑干发育不良,并且出现严重的智力和运动发育障碍。基因检测结果提示先证者携带TSEN2基因复合杂合突变:c.926A>G（p.Y309C）和c.882＿883insT（p.E295*）,父母均为杂合携带者。该家系母亲第二次妊娠产前羊水基因检测结果提示胎儿亦同时携带TSEN2基因复合杂合突变,与先证者一致,并且超声提示胎儿头围小于正常孕周。经充分交待后,家属选择引产。目前对TSEN2基因突变导致PCH2B的机制研究非常少,文献通常探讨TSEN2基因本身对tRNA催化功能的研究,但是其对于细胞尤其是神经细胞的影响报道尚少。因此,本课题拟根据前期发现的突变位点,构建突变型及野生型的TSEN2表达质粒,并研究二者对神经细胞的影响,阐明TSEN2基因复合杂合突变的功能及导致畸形表型的分子机制,使我们对该病的发生理解的更加充分,并为该家系的产前诊断及植入前诊断提供理论依据。方法:1、标本及细胞系收集PCH2B患者及家系成员的外周血样及羊水。该家系成员及监护人均签署知情同意书。小鼠海马神经元细胞系（HT22细胞）及人神经母细胞瘤细胞系（SHSY5Y细胞系）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。2、实验方法（1）应用全外显子测序结合Sanger测序的方法筛查PCH2B家系患者及成员基因突变;（2）应用在线生物信息学软件SWISS-MODEL Workspace预测野生型与突变型TSEN2蛋白的结构差异;（3）应用Sanger测序的方法对PCH2B家庭进行羊水产前基因诊断;（4）应用免疫组化及Western-blot方法检测引产胎儿脑组织中TSEN2表达情况;（5）合成人TSEN2基因及小鼠Tsen2基因野生型及突变型表达质粒,转染SHSY5Y细胞及HT22细胞,应用实时定量PCR检测Tsen2基因的mRNA表达水平,用Western-blot检测Tsen2蛋白表达水平;（6）观察SHSY5Y细胞及HT22细胞生物学特征（增殖、迁移和侵袭）。结果:1、对PCH2B家系进行突变检测后,发现TSEN2基因两个突变c.882＿883insT及c.926A>G,其中c.882＿883insT为新发现的突变,未见报道;2、对突变c.926A>G进行生物信息学分析,结果提示野生型与突变型TSEN2蛋白结构存在明显差异,c.882＿883insT可导致TSEN2蛋白截短;3、羊水基因检测结果提示胎儿为PCH2B患儿;4、胎儿脑组织中TSEN2表达降低;5、将两种突变型TSEN2基因表达载体转染SHSY5Y细胞及HT22细胞后,发现细胞中TSEN2基因mRNA及蛋白表达均下降。6、共转染两种突变型TSEN2基因表达载体后,SHSY5Y细胞及HT22细胞增殖水平降低,迁移和侵袭能力下降。结论:1、发现TSEN2基因c.882＿883insT及c.926A>G两个新突变,是PCH2B患者发病的原因;2、TSEN2基因突变抑制神经细胞的增殖、降低神经细胞的迁移和侵袭能力。
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