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目的:胶质瘤是由颅内和脊髓胶质细胞衍化而来的原发性恶性肿瘤,具有低治愈率和高死亡率的特点。在胶质瘤的发生与进展过程中,以瘤体为中心的周围环境发挥了重要作用,其中包括一部分免疫细胞,他们分泌大量的细胞因子,影响着肿瘤及其他组分的生物活性,被称为胶质瘤免疫微环境。作为免疫系统的一部分,巨噬细胞具有两种亚型,分别是促炎亚型M1和免疫抑制亚型M2,后者被发现在胶质瘤组织中呈现高度浸润。多项研究表明,胶质瘤相关巨噬细胞（GAMs）与胶质瘤的分化与进展密切相关,但是其机制尚不明确,并且其分泌的细胞因子IL-10也被发现能促进肿瘤细胞的生长与侵袭。此外,作为提取自人参的一种类固醇化合物,人参皂苷Rh2已被证实具有显著的抗胶质瘤活性,然而其对胶质瘤免疫微环境的影响仍不清楚。本研究欲探索M2型巨噬细胞对胶质瘤的影响及相应机制,并研究人参皂苷Rh2对胶质瘤微环境中巨噬细胞的干预效应,这为寻找胶质瘤相关的免疫治疗药物和揭示免疫细胞在肿瘤进展中扮演的角色提供了一定的参考意义。研究方法:1.为了探索巨噬细胞对胶质瘤的影响机制及临床意义,我们选取了来自Oncomine数据库的542例胶质母细胞瘤（GBM）组织和180例Ⅰ-Ⅳ级胶质瘤组织的mRNA测序数据作为分析基础。以CD163和CD206作为M2型巨噬细胞的分子标记物,以HLA-DPB1/MHCⅡ（HLA-DPB1为人类MHCⅡ分子中的beta链,能间接反映后者的表达情况）作为M1型巨噬细胞的分子标记物,并以上述分子的mRNA表达值作为其在胶质瘤组织中整体表达水平的指标,比较两种亚型的巨噬细胞在不同级别胶质瘤组织中的表达差异。利用Kaplan-Meier生存曲线法分析表达程度不同的两种巨噬细胞对GBM患者生存率的影响。机制部分,我们以542例GBM组织mRNA测序数据为分析基础,收集与CD163表达具有较强相关性的427个基因,进行富集分析,再根据MCODE评分和基因表达高低的临床意义筛选核心基因集团,最终利用KEGG肿瘤通路数据库搭建简易的TAMs促胶质瘤机制模型。2.为了研究人参皂苷Rh2对胶质瘤微环境中巨噬细胞的影响,我们利用THP-1细胞系分别诱导分化出M1和M2型巨噬细胞,再使用不同浓度的人参皂苷Rh2分别干预单独培养的M2细胞和培养于U87胶质瘤细胞微环境中的巨噬细胞,利用流式细胞术和细胞免疫荧光染色观察巨噬细胞的亚型极化状态,并使用ELISA法检测经Rh2影响的胶质瘤-巨噬细胞微环境中IL-10的蛋白含量变化。利用CCK8法观测两种亚型巨噬细胞对U87胶质瘤细胞的生长活性的影响,再加入Rh2观察其对前述效应的干预情况。利用划痕实验观察胶质瘤与胶质细胞对M2巨噬细胞迁移能力的影响,再加入Rh2观测其对前述效应的干预。3.为了探索巨噬细胞分泌因子IL-10在胶质瘤组织中的表达情况及其受人参皂苷Rh2的影响,我们分析了Oncomine数据库中Ⅰ-Ⅳ级胶质瘤组织的IL-10 mRNA表达值,并利用其中TCGA-GBM数据集的mRNA表达值,分析IL-10与巨噬细胞标记物CD163、CD206以及HLA-DPB1的表达相关关系。同时,我们在The Human Protein Atlas数据库中收集了IL-10、CD163以及HLA-DPB1分别在正常大脑皮层和高级别胶质瘤组织中的蛋白免疫染色图片。然后我们使用ELISA法检测经人参皂苷Rh2干预后的胶质瘤-巨噬细胞微环境中的IL-10的蛋白含量变化,并再次利用Oncomine中的数据分析IL-10在复发的GBM组织的表达变化情况,以及IL-10与MMP-7、MMP-9和VEGF-C等促胶质瘤因子的表达相关关系。结果:1.与正常脑组织和低级别胶质瘤组织相比,Ⅳ级胶质瘤组织中CD163的表达显著升高,且CD163/MHCⅡ的比值也显著增加,具有更高CD163表达值和CD163/MHCⅡ比值的GBM患者的总生存率更低。机制研究发现,与CD163共表达的基因群中,趋化因子及其受体家族以最为紧密的相互作用方式参与了GBM的进展,其中C-C基序趋化因子配体20（CCL20）,C-X-C基序趋化因子受体4（CXCR4）,补体成分5a受体1（C5AR1）以及C-X-C基序趋化因子配体8（CXCL8）是对GBM患者总生存率具有显著影响的核心基因,他们可能通过激活钙离子-丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和CXCR4-RAS同源家族成员A（RHOA）通路来促进GBM的生物学活性。2.CD163和CD206同为M2巨噬细胞标记物,实验表明,人参皂苷Rh2能降低原M2巨噬细胞中CD206的表达,增加M1巨噬细胞标记物MHCⅡ的表达量,而胶质瘤微环境中的巨噬细胞经Rh2处理后也表现出与前述相同的变化。Rh2也能抑制由M2巨噬细胞诱导的促U87胶质瘤细胞增殖效应和由胶质瘤细胞介导的促M2巨噬细胞迁移效应。3.相比于非肿瘤脑组织,高级别胶质瘤组织中的IL-10mRNA和蛋白都具有更高的表达量,而且巨噬细胞相关标记物CD163、HLA-DPB1等的mRNA表达值以及蛋白含量也显著升高。据mRNA的表达值分析,IL-10分别与CD163、CD206和HLA-DPB1具有显著的表达正相关性,其中与CD206的相关系数最高。相比于未复发的GBM患者,IL-10 mRNA在复发的GBM患者的肿瘤组织中表达升高,且与MMP-7,MMP-9以及VEGF-C等编码促胶质瘤侵袭和血管生成因子的基因具有显著的表达正相关性。而人参皂苷Rh2能显著降低胶质瘤-巨噬细胞微环境中IL-10的蛋白含量。结论:1.M2型巨噬细胞标记物在GBM组织中呈现高度表达状态,其表达程度越高,GBM患者的总生存率越低,预后较差。M2型巨噬细胞可能通过分泌大量的趋化因子并激活相应受体,引起胶质瘤细胞或整个肿瘤微环境各细胞组分的级联反应,通过活化钙离子-MAPK通路,CXCR4-RHOA通路以及c AMP通路等促进GBM的生长,侵袭以及凋亡逃逸等生物学行为。2.人参皂苷Rh2能显著降低GAMs中M2型细胞的比例,并抑制M2型GAMs的迁移能力和其促胶质瘤细胞生长的效应。3.GBM组织中IL-10的表达显著升高,这种现象可能与M2型巨噬细胞在GBM组织中的高度浸润相关,而高表达的IL-10可能与GBM的复发和促瘤因子的分泌增加具有一定程度的关联性。人参皂苷Rh2能在促进胶质瘤微环境中巨噬细胞M1极化的同时降低IL-10的蛋白含量,这为揭示Rh2的抗胶质瘤活性的机制提供了新的思路。