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第一部分糖尿病足患者和对照组患者血液中外泌体的分离和功能验证目的:外泌体作为一种新型纳米级生物材料和药物载体,其对体内生物学行为的调节作用已经受到越来越多学者的关注。糖尿病创面迁延不愈,对患者造成很大影响,是临床上常见的难题之一。糖尿病患者血液中富含外泌体,通过对血液中外泌体的生物学功能的研究,将为治疗难愈性的糖尿病创面提供崭新的思路。方法:使用超速离心的方法提取两组患者血液中的外泌体,使用透射电镜（TEM）的方法观察所提取的外泌体镜下的形态,使用动态光散射（DLS）测量提取的外泌体的粒径,使用蛋白印迹法（WB）对提取的外泌体的标志物CD 81和TSG 101进行鉴定,使用PKH26荧光染色的方法对提取的外泌体进行示踪检测,观察其被HUVECs摄取的情况;通过细胞的EDU荧光染色、细胞活性检测（CCK-8）、WB、实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）、流式细胞周期测量等方法观察提取的外泌体对HUVECs增殖能力的影响;通过流式细胞凋亡测量、WB、qRT-PCR等方法观察提取的外泌体对HUVECs凋亡情况的影响;通过细胞成管能力检测的方法观察提取的外泌体对HUVECs成管能力的影响;通过建造小鼠背部创面模型,观察提取的外泌体对创面愈合的影响,通过小动物多普勒检查,观察各组小鼠创面的血流灌注情况,通过创面处皮肤的CD 31免疫组化检测,观察各组小鼠创面处新生血管情况。结果:TEM显示两组外泌体的形态为盘状或者半球形,DLS显示两组外泌体的粒径均在30-200nm之间,在两组外泌体中通过WB均能检测到外泌体标志物CD 81和TSG101双阳性,PKH26示踪试验证实两组外泌体均可被HUVECs吞噬和摄取;EDU荧光染色、CCK-8、WB、qRT-PCR、WB和流式细胞周期检测提示糖尿病患者血液中的外泌体（Diabete-Exos）可以明显抑制HUVECs的增殖,并且随着浓度的提升,这种抑制作用越明显,流式细胞凋亡检测、WB和qRT-PCR提示Diabete-Exos可以促进HUVECs凋亡,并且呈现浓度梯度改变,成管实验提示Diabete-Exos可以明显抑制HUVECs的成管能力,这种调节呈现浓度梯度改变;体内实验表明Diabete-Exos可以明显延迟小鼠背部创面愈合、减少创面的血量灌注量和创面处新生血管的形成,这种调节呈现浓度梯度改变。结论:Diabete-Exos可以被HUVECs摄取,进而抑制HUVECs的功能和促进其凋亡,导致创面处新生血管和血流灌注量减少,从而延迟创面愈合。第二部分糖尿病足患者血液中外泌体内miR-20b-5p的测定和功能研究目的:miR-20b-5p之前已被证实在糖尿病患者血液的外泌体中高水平表达,但是对这种外泌体来源的miR-20b-5p对糖尿病创面的影响并没有文献报道,我们希望通过对这种外泌体来源的miR-20b-5p的功能进行研究,以期发现Diabete-Exos对创面作用的潜在机制。方法:通过qRT-PCR的方法检测Diabete-Exos和对照组患者血循环中外泌体（Normal-Exos）中的miR-20b-5p水平,以及分别由Diabete-Exos和Normal-Exos干预的HUVECs中的miR-20b-5p的水平;分别使用CCK-8、EDU荧光染色、WB、qRT-PCR和流式细胞周期检测等方法检测敲除miR-20b-5p后的Diabete-Exos对HUVECs增殖的影响;通过流式细胞凋亡检测、WB和qRT-PCR等方法检测敲除miR-20b-5p后的Diabete-Exos对HUVECs凋亡的影响;通过细胞成管试验检测敲除miR-20b-5p后的Diabete-Exos对HUVECs成管能力的影响;通过CCK-8、EDU荧光染色、WB、qRT-PCR、流式细胞检测和细胞成管试验检测miR-20b-5p对HUVECs功能、凋亡和成管能力的影响;通过注射链脲霉素的方法建造糖尿病小鼠模型,并通过杂交法获得miR-20b-5p基因敲除糖尿病小鼠,分别观察miR-20b-5p对普通创面的影响,以及敲除miR-20b-5p后的糖尿病小鼠的创面愈合情况,通过小动物多普勒检测观察各组小鼠创面处的血流情况,通过CD 31免疫组化检测观察各组小鼠创面新生血管情况。结果:qRT-PCR结果提示Diabete-Exos中以及Diabete-Exos处理的HUVECs中的miR-20b-5p的水平明显高于其他组,加入miR-20b-5p抑制剂后,Diabete-Exos对HUVECs的损害作用明显得到缓解;抑制miR-20b-5p可以明显增强HUVECs的增殖和成血管能力,以及延缓其凋亡速率;体内实验表明抑制miR-20b-5p可以明显加快小鼠背部创面愈合、增加创面的血量灌注量和创面处新生血管的形成,敲除miR-20b-5p后的糖尿病小鼠其创面愈合速率、血流灌注情况以及新生血管情况明显优于普通糖尿病小鼠组。结论:抑制Diabete-Exos中的miR-20b-5p的表达可以明显减弱Diabete-Exos对HUVECs和创面的不利作用,miR-20b-5p的异常高水平是Diabete-Exos延迟创面愈合的潜在作用机制。第三部分外泌体来源的miR-20b-5p发挥调节作用的机制研究目的:外泌体来源的miR-20b-5p被证实对HUVECs和糖尿病创面具有强大的调节作用,其潜在的作用机制需要进一步深入研究。方法:通过miRNA靶基因的预测工具miRBase、Target Scan和miRanda预测miR-20b-5p的潜在下游靶基因,利用双荧光素酶检测筛选出的靶基因与miR-20b-5p的结合能力,通过qRT-PCR的方法检测抑制或者过表达miR-20b-5p对靶基因的表达的影响,通过EDU荧光染色、WB、流式细胞术和细胞成管试验检测抑制靶基因表达对各处理组细胞的生存能力和成管能力的影响。结果:Wnt9b为miR-20b-5p潜在的下游调控机制之一,双荧光素酶试验证实miR-20b-5p可以与Wnt9b紧密结合,过表达miR-20b-5p可以明显抑制Wnt9b的表达,沉默Wnt9b后可以明显抑制Wnt9b和β-Catenin的表达,并且可以明显降低HUVECs的增殖和成管能力,加快HUVECs的凋亡。结论:Wnt9b/β-Catenin信号通路是Diabete-Exos来源的miR-20b-5p对创面愈合发挥调节作用的重要的分子机制。