论文部分内容阅读
目的:动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是一种以大中弹性动脉壁变硬增厚,动脉内腔逐渐积累包括脂质和免疫细胞的斑块为特点的疾病。晚期的动脉斑块破裂或侵蚀引起急性血栓形成导致的急性冠脉综合征是主要死亡原因之一。脂代谢异常在动脉粥样硬化的发生发展中的作用已被证实,但在临床上一些心血管疾病患者即使在最优治疗下包括脂质降至正常水平,炎症仍是一个重要的心血管残余危险因素。巨噬细胞在动脉粥样硬化的发生发展中起重要作用,它是动脉粥样硬化斑块中占比最大的免疫细胞类型。巨噬细胞在不同微环境的条件刺激作用下如氧化低密度脂蛋白、细胞因子以此获得不同表型和功能,经典的巨噬细胞在不同刺激因子作用下极化为促炎型M1样巨噬细胞和抗炎型M2样巨噬细胞两种表型。随着单细胞技术的快速发展,小鼠和人动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞亚群被更精确的绘制出。不同单细胞测序研究描述动脉粥样硬化斑块中炎症型巨噬细胞的存在和表型,并且这些炎症型巨噬细胞有许多经典促炎转录脚本,炎症反应是炎症型巨噬细胞最显著的富集途径。因此巨噬细胞是一个具有前景的治疗靶点。青蒿素是从黄花蒿中提取而来的倍半萜三恶烷内酯类化合物。青蒿素在临床上最早用于抗疟疾治疗,几年来由于其具有良好的安全性以及对多种信号通路的有效药理作用,目前已在多种炎症疾病模型中进行了研究。在青蒿素家族中,青蒿琥酯（Artesunate,ART）是研究最多的类似物,因为它添加了半琥珀酸基团,具有极高的水溶性和高口服生物利用度,从而产生更有利的药理特征。本研究应用高脂饮食喂养Apo E-/-小鼠建立动脉粥样硬化模型,脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞和骨髓来源巨噬细胞（BMDM）建立促炎模型,应用非靶向代谢组学检测探究AS小鼠体内哪些代谢产物及代谢途径发生变化,通过生信分析寻找青蒿琥酯发挥抗AS途径,我们发现青蒿琥酯通过调控HIF-1α/Furin通路抑制巨噬细胞向M1样极化进而延缓动脉粥样硬化形成,为青蒿琥酯治疗炎症性疾病提供基础实验证据。研究方法:第一部分:青蒿琥酯通过抑制巨噬细胞向M1样极化延缓动脉粥样硬化1、体内实验:本研究选取已被证明是AS的理想模型Apo E-/-小鼠建立AS模型,研究分以下4组:（1）对照组:（Con组）:普通饮食喂养8周;（2）动脉粥样硬化组（AS组）:高脂饮食（21%脂肪,0.15%胆固醇,北京华阜康NO:H10141）喂养8周;（3）青蒿琥酯低剂量组（ART-L组）:高脂饮食喂养8周+青蒿琥酯30mg/kg/d灌胃治疗8周;（4）青蒿琥酯高剂量组（ART-H组）:高脂饮食喂养8周+青蒿琥酯60mg/kg/d灌胃治疗8周。对小鼠主动脉根部动脉粥样硬化斑块行油红O和HE染色,评估动脉粥样硬化斑块和坏死核心面积大小;Western blot检测小鼠主动脉M1、M2标志物蛋白表达水平;ELISA检测小鼠血浆炎症因子分泌和血脂水平;免疫荧光双染检测小鼠主动脉斑块内巨噬细胞M1标志物i NOS、M2标志物CD206表达。2、体外实验:本研究选取RAW264.7细胞和骨髓来源巨噬细胞（BMDM）给予LPS诱导为炎症型M1样巨噬细胞,研究分以下4组:（1）Con组:培养基培养,不加干预;（2）LPS组:加入100ng/ml LPS培养24小时;（3）ART10μM组:加入ART10μM预培养4小时,再加入100ng/ml LPS继续培养24小时;（4）ART20μM组:加入ART20μM预培养4小时,再加入100ng/ml LPS继续培养24小时;本研究选取RAW264.7细胞给予IL-4诱导为抗炎型M2样巨噬细胞,实验分为4组:（1）Con组:培养基培养,无干预;（2）IL-4组:加入20 ng/m L IL-4培养48小时;（3）ART10μM组:加入ART 10μM预处理4小时,再加入20 ng/m L IL-4继续培养48小时;（4）ART20μM组:加入ART 20μM预处理4小时,再加入20 ng/m L IL-4继续培养48小时。CCK8检测不同浓度ART对LPS诱导的M1样RAW264.7细胞活力影响;ELISA检测RAW264.7细胞上清液炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平和BMDM细胞上清液炎症因子IL-1β水平;Western blot检测RAW264.7细胞M1样标志物i NOS、TNF-α、IL-6、IL-1β,M2样标志物TGF-β1、CD206蛋白表达水平和BMDM细胞M1样标志物i NOS、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平;流式细胞实验检测各组RAW264.7细胞中M1样巨噬细胞占总巨噬细胞比例。第二部分:基于非靶向代谢组学测序探究青蒿琥酯发挥抗Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化病变作用选取Con组、AS组、ART-L组小鼠血浆行非靶向代谢组学检测,利用PLS-DA得分和排序验证对小鼠血浆代谢组学数据质控;筛选Con组/AS组,AS组/ART-L组差异代谢物及差异生化代谢通路;KEGG富集分析寻找ART发挥抗动脉粥样硬化所参与通路;分子对接预测ART与HIF-1α存在结合位点;免疫荧光染色检测小鼠主动脉斑块内巨噬细胞内HIF-1α表达。第三部分:青蒿琥酯调控HIF-1α/Furin通路抑制巨噬细胞向M1样极化免疫荧光双染检测小鼠主动脉斑块内巨噬细胞和RAW264.7细胞Furin表达;Western blot检测小鼠主动脉Furin蛋白表达水平;通过转染si RNA下调Furin在RAW264.7细胞系中表达后应用LPS刺激建立促炎型M1样细胞模型,western blot检测si NC组、si Furin组、si NC+LPS组、si Furin+LPS组M1样标志物和HIF-1α蛋白表达水平;通过转染si RNA下调HIF-1α在RAW264.7细胞系中表达水平后应用LPS刺激建立促炎型M1样细胞模型,western blot检测si NC组、si HIF-1α组、si NC+LPS组、si HIF-1α+LPS组M1样标志物和Furin蛋白表达水平;通过感染慢病毒上调HIF-1α在RAW264.7细胞系中表达后应用LPS刺激建立促炎型M1样细胞模型,western blot检测LV-NC组、LV-HIF-1α组、LV-NC+LPS组、LV-HIF-1α+LPS组、LV-HIF-1α+LPS+ART组检测M1样标志物和Furin蛋白表达水平。结果:第一部分:青蒿琥酯通过抑制巨噬细胞向M1样极化延缓动脉粥样硬化1、HE和油红O染色显示AS组小鼠主动脉斑块面积及坏死核心大小较Con组显著增加,经ART治疗后主动脉斑块面积及坏死面积显著减少。2、ELISA检测小鼠血浆血脂四项显示AS组胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白较Con组显著增加,ART治疗后未降低血浆胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平。AS组高密度脂蛋白较Con组显著降低,ART-H组治疗后高密度脂蛋白较AS组升高。3、ELISA法检测小鼠血浆中炎性细胞因子表达,AS组TNF-α、IL-6含量较Con显著升高,ART治疗后TNF-α、IL-6水平较AS组显著降低;Western blot法检测小鼠主动脉组织中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达趋势同ELISA一样,AS组M1样标志物i NOS蛋白表达升高,M2样标志物CD206蛋白表达降低,ART治疗后降低M1标志物蛋白表达水平增加M2样标志物蛋白表达水平;免疫荧光显示AS组小鼠主动脉斑块巨噬细胞内i NOS表达增加、CD206表达减少,M1/M2比例增加,ART治疗扭转这种改变。4、CCK-8检测当ART浓度≤40μM时ART对LPS刺激的RAW264.7活力无影响,当ART浓度≥80μM时对LPS刺激的RAW264.7细胞活力有明显的抑制作用。5、Western blot检测LPS组M1样标志物较Con组显著增加,ART-L、ART-H治疗组M1样标志物较LPS组显著降低。6、Western blot检测IL-4组M2样标志物较Con组显著增加,ART-H治疗组M2样标志物较IL-4组显著增加。第二部分:基于非靶向代谢组学测序探究青蒿琥酯发挥抗Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化病变作用非靶向代谢组学结果显示:Con组/AS组有312个显著差异表达的代谢物,其中179个上调,133个下调;AS组/ART-L组有182个显著差异表达的代谢物,其中134个表达上调,48个表达下调。小鼠血浆主要发生改变的生化代谢途径,包括核苷酸代谢、萜类和多酮类化合物代谢、氨基酸代谢、维生素代谢、脂类代谢等。KEGG通路分析显示,HIF-1信号通路在Con组/AS组、AS组/ART-L组间显著富集。分子对接预测ART与HIF-1α存在结合位点。免疫荧光染色显示HIF-1α在ART治疗的小鼠主动脉斑块内巨噬细胞、LPS诱导的炎症型M1样巨噬细胞中表达减少。第三部分:青蒿琥酯调控HIF-1α/Furin通路抑制巨噬细胞向M1样极化（1）Western blot检测显示ART治疗减轻小鼠主动脉和LPS诱导的炎症型M1样RAW264.7细胞HIF-1α和Fruin蛋白表达水平;免疫荧光染色显示Furin在ART治疗的小鼠主动脉斑块内巨噬细胞、LPS诱导的炎症型M1样RAW264.7细胞中表达减少。（2）Western blot检测显示的si Furin的RAW264.7细胞si Furin+LPS组M1样标志物表达较si NC+LPS组减少,HIF-1α表达无差异;（3）Western blot检测显示si HIF-1α的RAW264.7细胞si HIF-1α+LPS组M1样标志物和Furin蛋白表达水平较si NC+LPS组减少;（4）Western blot检测显示LV-HIF-1α的RAW264.7细胞LV-HIF-1α+LPS组较LV-NC+LPS组M1样标志物和Furin蛋白表达水平显著增加,LV-HIF-1α+LPS+ART组较LV-HIF-1α+LPS组M1样标志物和Furin蛋白表达水平显著降低;结论:1、ART抑制巨噬细胞向促炎型M1样极化,抑制炎症因子分泌,通过抗炎发挥抗AS作用。非靶向代谢组学结果显示ART纠正AS小鼠体内紊乱代谢通路,KEGG富集分析及分子对接结果提示HIF-1α蛋白为ART发挥抗动脉粥样硬化调控蛋白之一。3、LPS诱导的巨噬细胞向促炎型M1样极化过程中Furin表达升高,且受HIF-1α调节,ART通过调控HIF-1α/Furin通路抑制LPS诱导的巨噬细胞向M1样极化。