目的：　　脓毒症（sepsis）是感染或感染因素导致的宿主反应失调所引起的危及生命的多器官功能障碍综合征[1]。其发病率高，病情凶险，是全球危重病人死亡的主要原因。脓毒症的发生与过度炎症以及免疫抑制有关[2, 3]。其中，单核-吞噬细胞作为先天免疫系统的重要组成细胞，在脓毒症的发生发展过程中发挥重要作用。　　存在于革兰阴性菌外膜的脂多糖/内毒素（lipopolysaccharide/endotoxin，LPS）是诱导脓毒症发生的主要病原分子，能够作用于机体免疫细胞尤其是单核-吞噬细胞，诱导细胞释放大量的TNF-α、IL-6等前炎症细胞因子[4]，参与脓毒症的发生。　　自噬（autophagy）是细胞内物质在溶酶体中被降解过程的统称[5]，是细胞的重要自我保护机制，在维持正常的生命活动过程中发挥重要作用。研究表明，自噬与机体的免疫应答密切相关。有文献报道，巨噬细胞自噬功能的改变与脓毒症模型小鼠的免疫功能的改变密切相关[6]，LPS诱导的巨噬细胞自噬过程的改变参与脓毒症的发生[7]。　　本课题组长期致力于青蒿素及其衍生物的临床新适应症的研究和机制探讨。前期研究发现青蒿琥酯(artesunate，AS)具有很好的抗炎作用。AS 在热灭活大肠埃希菌/金黄色葡萄球菌攻击小鼠脓毒症模型、活菌攻击小鼠脓毒症模型、大鼠/小鼠盲肠结扎穿孔术脓毒症模型以及LPS攻击小鼠脓毒症模型中均具有保护作用，能够显著降低血清中致炎因子TNF-α和IL-6水平[8-11]。在体外，AS抑制LPS诱导的RAW264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞前炎症细胞因子（TNF-α和IL-6）释放，其机制与抑制TLR4表达和抑制NF-κB活化有关[10]。　　既然LPS诱导的前炎症细胞因子释放与自噬密切相关[12]，AS的抗炎作用于其抑制前炎症细胞因子释放有关，那么 AS 的抗炎作用是否与其影响自噬有关呢？因此，本研究聚焦于AS的抗炎作用于自噬之间的关系，采用LPS诱导的巨噬细胞活化模型，基于LPS诱导的自噬开展工作：首先明确AS对LPS诱导的TLR4-NF-κB信号转导途径的影响，然后确定AS对LPS诱导的巨噬细胞自噬的影响并探讨其可能的机制。　　方法：　　一、AS对巨噬细胞中LPS诱导的TLR4-NF-κB信号转导途径的影响　　1. AS抑制LPS诱导的前炎症细胞因子释放作用的再确认　　1.1. LPS浓度的确定采用ELISA方法检测不同浓度LPS诱导RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-6水平，确定后续实验LPS的工作浓度。　　1.2. AS浓度的确定采用ELISA方法检测不同浓度AS对100 ng/mLLPS诱导的RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-6水平的影响，确定后续实验AS工作浓度。　　1.3. AS对LPS诱导的不来源的巨噬细胞前炎症细胞因子释放的影响采用ELISA方法检测AS对LPS诱导的骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophage， BMDMs)和小鼠腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage，PMs)释放TNF-α和IL-6水平的影响。　　2. AS对LPS诱导的TLR4-NF-κB信号转导途径的影响　　2.1. AS对LPS诱导的巨噬细胞TLR4的影响　　2.1.1. AS对LPS诱导TLR4蛋白表达的影响　　(1) 采用激光共聚焦显微镜观察AS对LPS诱导RAW264.7细胞TLR4蛋白分布和表达的影响。　　(2) 采用WB方法检测AS对LPS诱导RAW264.7细胞TLR4蛋白表达的影响。　　2.1.2.敲除Tlr4对AS抗炎作用的影响 采用 ELISA方法检测在Tlr4敲除的小鼠腹腔巨噬细胞中AS对LPS诱导的TNF-α和IL-6释放的影响。　　2.2. AS对LPS诱导的MyD88和TRIF蛋白表达的影响 采用WB方法检测AS对LPS诱导的MyD88和TRIF蛋白表达的影响。　　2.3. AS对LPS诱导的TRAF6的影响　　2.3.1. AS对LPS诱导的TRAF6蛋白表达的影响 采用WB方法检测AS对LPS诱导的RAW264.7细胞TRAF6蛋白表达的影响。　　2.3.2.敲降Traf6对AS抗炎作用的影响 ELISA方法检测Traf6敲降后AS对LPS诱导的腹腔巨噬细胞TNF-α和IL-6释放的影响。　　2.4. AS对LPS诱导的MAPK通路活化中重要分子的影响　　2.4.1. AS对LPS诱导的p38和p-p38蛋白表达的影响 采用WB方法检测AS对LPS诱导的RAW264.7细胞p38和p-p38蛋白表达的影响。　　2.4.2. AS对LPS诱导的JNK和p-JNK蛋白表达的影响 采用WB方法检测AS对LPS诱导的RAW264.7细胞JNK和p-JNK蛋白表达的影响。　　2.4.3. AS对LPS诱导的ERK和p-ERK蛋白表达的影响 采用WB方法检测AS对LPS诱导的RAW264.7细胞ERK和p-ERK蛋白表达的影响。　　2.5AS对LPS诱导NF-κB p65、p50活化及IκBα磷酸化的影响采用WB方法检测AS对LPS诱导的p50、p65、p-IκBα表达的影响。　　二、AS对LPS诱导的巨噬细胞中自噬相关信号途径的影响及其机制研究　　1. 抑制自噬对AS抗炎作用的影响　　1.1.自噬抑制剂对AS抗炎作用的影响采用自噬抑制剂3-MA、bafilomycin A1，采用ELISA方法检测上述自噬抑制剂对AS抗炎作用的影响。　　1.2敲降自噬激活关键基因 Atg5 对 AS 抗炎作用的影响 采用Atg5 siRNA干扰atg5，采用ELISA方法检在Atg5被敲降后的细胞中AS抗炎作用的改变。　　2. AS对LPS诱导的巨噬细胞中自噬的影响　　2.1. LPS诱导RAW264.7、BMDMs自噬关键蛋白表达的动态变化 采用WB方法检测在LPS诱导的RAW264.7和BMDMs细胞中自噬关键蛋白LC3B、ATG5、SQSTM1的动态表达情况，确定样品收集时间。　　2.2. AS对LPS诱导巨噬细胞中自噬的影响　　2.2.1. AS对RAW264.7细胞中自噬体样囊泡状结构的影响 采用透射电镜观察AS对RAW264.7细胞中自噬样囊泡状结构数量的影响。　　2.2.2. AS对LPS诱导的巨噬细胞中自噬关键分子的影响 采用激光共聚焦显微镜观察AS对LPS诱导的巨噬细胞中LC3斑点数量的影响；采用WB方法检测AS对自噬关键分子LC3B、ATG5、SQSTM1的蛋白表达的影响。　　2.2.3. AS抑制LPS诱导巨噬细胞中自噬过程的作用环节研究　　(1) AS对LPS诱导巨噬细胞中自噬LC3B表达的影响 采用mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系，激光共聚焦显微镜观察AS对LPS诱导的巨噬细胞中自噬标志分子LC3B蛋白表达的影响。　　(2) 敲降自噬激活关键基因(Atg5)对 AS 作用的影响 在自噬激活关键基因(Atg5)敲降的巨噬细胞中，采用激光共聚焦显微镜观察AS对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞中自噬斑点的影响；采用WB方法检测AS对LPS诱导的自噬标志蛋白表达的影响。　　3. AS对LPS诱导巨噬细胞中TLR4-TRAF6-Beclin1-PI3KC3自噬通路的影响　　3.1. AS抑制LPS诱导的自噬作用于TLR4密切相关 在Tlr4敲除巨噬细胞中，采用激光共聚焦显微镜观察AS对LPS诱导的LC3斑点的影响；WB方法检测AS对LPS诱导的ATG5和LC3B蛋白表达的影响。　　3.2. AS抑制LPS诱导的自噬作用于TRAF6密切相关 在Traf6敲降巨噬细胞中，采用激光共聚焦显微镜观察 AS 对 LPS 诱导的自噬斑点的影响；采用 WB 方法检测AS对LPS诱导的ATG5和LC3B蛋白表达的影响。　　3.3. AS对LPS诱导的自噬上游TRAF6-Beclin1-PI3KC3通路的影响　　3.3.1. LPS对TRAF6-Beclin1-PI3KC3通路的影响采用WB方法迹检测在LPS诱导的TRA6、Beclin1、PI3KC3、p-PI3KC3蛋白表达的动态变化情况。　　3.3.2. AS对LPS诱导的自噬上游TRAF6-Beclin1-PI3KC3通路的影响采用WB方法检测AS对LPS诱导的RAW264.7、BMDMs细胞中TRAF6、Belcin、PI3KC3、p-PI3KC3蛋白表达的影响。　　3.3.3. 敲降Traf6对AS抑制LPS诱导的自噬上游TRAF6-Beclin1-PI3KC3通路的影响 WB方法检测Traf6被敲降后 AS 对 LPS 诱导的TRAF6、Beclin1、PI3KC3、p-PI3KC3蛋白表达的影响。　　3.4. AS对TRAF6介导的PI3KC3复合物活化的影响　　3.4.1. AS对TRAF6介导Beclin1的K63泛素化的影响　　(1) AS对TRAF6-Beclin1相互作用的影响 采用IP方法检测AS对TRAF6-Beclin1相互作用的影响。　　(2) AS 对 TRAF6-Beclin1 共定位的影响 采用激光共聚焦显微镜观察 AS 对TRAF6-Beclin1共定位的影响。　　(3) AS对LPS诱导的Beclin1泛素化的影响 采用IP方法检测AS对TRAF6介导的Beclin1 K63泛素化的影响。　　3.4.2 AS对Beclin1-PI3KC3相互作用的影响　　(1) AS 对 Beclin1-PI3KC3 相互作用的影响 采用 IP 方法检测 AS 对Beclin1-PI3KC3相互作用的影响。　　(2) AS 对 Beclin1-PI3KC3 共定位的影响 采用激光共聚焦显微镜观察 AS 对Beclin1-PI3KC3共定位的影响。　　结果：　　一、AS对LPS诱导的TLR4-NF-κB信号转导途径的影响　　1. AS抑制LPS诱导前炎症细胞因子（TNF-α和IL-6）释放作用的再确认　　1.1. LPS可显著诱导RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-6，并呈显著的量效关系，在本研究中LPS的工作浓度确定为100 ng/mL。　　1.2. AS可显著抑制LPS诱导的RAW264.7释放TNF-α和IL-6，并呈一定的量效关系，在本研究中AS的工作浓度确定为20 μg/mL。　　1.3. AS可显著抑制LPS诱导的小鼠PMs、BMDMs释放TNF-α、IL-6。　　2. AS对LPS诱导的TLR4-NF-κB信号转导途径的影响　　2.1. AS对LPS诱导的巨噬细胞中TLR4的影响　　2.1.1.激光共聚焦显微镜的观察结果和WB方法检测结果显示，AS能够抑制LPS诱导的TLR4分布和蛋白表达。　　2.1.2. 在Tlr4敲除细胞中，LPS诱导细胞因子的释放作用减弱，AS抑制细胞因子释放的作用消失。　　2.2. WB方法检测结果显示，AS可显著抑制LPS诱导的TLR4信号转导通路中重要衔接蛋白MyD88、TRIF蛋白的表达。　　2.3. AS对LPS诱导的TRAF6的影响　　2.3.1. WB方法检测结果显示，AS可抑制LPS诱导的TRAF6蛋白表达。　　2.3.2. 在Traf6敲降的细胞中，LPS的致炎作用和AS抗炎作用均减弱。　　2.4. AS对LPS诱导的MAPK通路活化中重要分子的影响　　2.4.1. AS对LPS诱导的p38和p-p38蛋白的表达均有抑制作用。　　2.4.2. AS对LPS诱导的JNK的蛋白表达无影响，但对p-JNK的蛋白表达有抑制作用。　　2.4.3. AS对LPS诱导的ERK和p-ERK的蛋白表达均无影响。　　2.5.AS对LPS诱导IκBα磷酸化及NF-κB p65/p50活化的影响WB方法检测结果显示，AS可抑制LPS诱导的IκBα磷酸化和p50、p65的活化入核，其中对p65的作用最强。　　二、AS对LPS诱导的巨噬细胞中自噬相关信号途径的影响及其机制研究　　1. 抑制自噬对AS抗炎作用的影响　　1.1.自噬抑制剂3-MA、bafilomycin A1预处理后，LPS致炎作用和AS抗炎作用均减弱，提示AS抗炎作用可能与自噬有关。　　1.2.在自噬激活关键基因Atg5敲降细胞中，LPS致炎作用和AS抗炎作用均减弱，提示AS的抗炎作用可能与抑制自噬过程有关。　　2. AS对LPS诱导的巨噬细胞中自噬的影响　　2.1. LPS能够诱导RAW264.7细胞发生自噬，且LC3B-II、ATG5的达峰时间为1 h， SQSTM1的表达随时间增加而增加。因此，本研究中确定自噬指标的检测的最佳时相点为1h。　　2.2. AS对LPS诱导的巨噬细胞中自噬的影响　　2.2.1.透射电镜观察结果显示，AS能够显著减少LPS诱导的RAW264.7细胞中自噬体样囊泡状结构的数量。　　2.2.2.激光共聚焦显微镜观察结果显示，AS抑可制LPS诱导的LC3斑点数量的增加；WB方法检测结果显示，AS可抑制LPS诱导的RAW264.7、BMDMs细胞中LC3B-II、ATG5的蛋白表达，但对SQSTM1的蛋白表达无影响。　　2.2.3. AS抑制LPS诱导的巨噬细胞中自噬作用环节的研究　　(1) mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系显示，AS作用于LPS诱导的自噬激活阶段。　　(2) 在Atg5敲降细胞中，激光共聚焦显微镜观察结果显示，LPS诱导的自噬斑点不能形成；WB方法检测结果显示，LC3B-II蛋白的表达减少，同时AS对LC3B-II的抑制作用消失，再次说明AS作用于LPS诱导的自噬激活阶段。　　3. AS对LPS诱导巨噬细胞中TLR4-TRAF6-Beclin1-PI3KC3自噬通路的影响　　3.1. 激光共聚焦显微镜观察结果显示，在Tlr4敲除细胞中，LPS不能诱导LC3斑点形成，AS对LC3B-II的抑制作用消失，WB方法检测得到类似的结果；以上结果说明AS抗炎作用和自噬抑制作用是TLR4依赖的。　　3.2. 激光共聚焦显微镜观察结果显示，在Traf6敲降细胞中，LPS诱导的自噬斑点数量减少，AS对LC3斑点的抑制作用消失；WB方法检测结果显示，AS对LC3B-II的抑制作用消失。上述结果说明AS自噬抑制作用于TRAF6密切相关。　　3.3. AS对LPS诱导的自噬上游TRAF6-Beclin1-PI3KC3通路的影响　　3.3.1. WB方法检测结果显示，LPS诱导的TRAF6、Beclin1、PI3KC3、p-PI3KC3 蛋白表达均在1 h达峰。因此在本研究中，选择1 h时作为检测TRAF6-Beclin1-PI3KC3通路中蛋白表达的时相点。　　3.3.2. AS可抑制LPS诱导的RAW264.7、BMDMs细胞中TRAF6、Beclin1、PI3KC3、p-PI3KC3表达，说明AS能够抑制TRAF6-Beclin1-PI3KC3通路活化。　　3.3.3. 在Traf6敲降细胞中，LPS不能诱导Beclin1、PI3KC3、p-PI3KC3蛋白表达的增加，AS对Beclin1、PI3KC3、p-PI3KC3蛋白表达的抑制作用消失，说明TRAF6是LPS诱导的自噬和AS自噬抑制作用过程中的关键分子。　　3.4. AS对TRAF6介导的PI3KC3复合物活化的影响　　3.4.1. AS对TRAF6介导Beclin1的K63泛素化的影响　　(1) IP方法检测结果显示，当Beclin1的蛋白量一致时，各组Beclin1结合的TRAF6的量无明显差别；当TRAF6的蛋白量一致时，AS可抑制LPS诱导的TRAF6与Beclin1结合的增加，提示AS可能通过作用于TRAF6从而抑制Beclin1的活化。　　(2) 激光共聚焦显微镜观察结果显示，AS 能够抑制 LPS 诱导的 TRAF6-Beclin1共定位。　　(3)IP方法检测结果进一步确认，AS可抑制TRAF6介导的Beclin1 K63的泛素化。　　3.4.2. AS对Beclin1-PI3KC3核心复合物活化的影响　　(1) IP方法检测结果显示，当Beclin1的蛋白量一致时，AS组Beclin1结合PI3KC3增加，提示AS影响Beclin1与PI3KC3的结合；当PI3KC3的蛋白量一致时，AS组AS PI3KC3结合Beclin1增加，提示AS影响PI3KC3与Beclin1的结合。说明AS影响Belcin1与PI3KC3的相互作用。　　(2) 激光共聚焦显微镜结果显示，AS能够抑制LPS诱导的Beclin1与PI3KC3共定位。　　结论　　1. AS具有显著的抗炎作用，该作用于其抑制LPS诱导的TLR4-NF-κB信号通路有关。　　2. AS的抗炎作用于其抑制自噬过程密切相关，其对自噬的影响主要表现在自噬激活环节的影响。　　3. AS对LPS-TLR4-NFκB炎症信号转导途径和自噬通路的抑制作用既与抑制通路中关键分子表达有关，又与抑制TRAF6的E3泛素连接酶活性有关。