第一章阿托伐他汀调节胰岛素抵抗大鼠血浆ADMA/NO，主动脉SREBP1、DDAH1表达的研究　　目的:内皮功能紊乱是心血管疾病发生的主要危险因素，同时也可导致机体对胰岛素敏感性下降，引起胰岛素抵抗(insulinresistanceIR)。非对称性二甲基精氨酸(AsymmetricdimethylarginineADMA)、内源性一氧化氮合酶(NOS)抑制剂，可损伤内皮功能，已被公认为心血管疾病的危险因子。二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylargininedimethylaminohydrolaseDDAH)可将内源性ADMA降解为L-瓜氨酸，从而增加NO的合成，改善内皮功能。他汀类药物已被公认为可改善内皮细胞功能，降低心血管事件发生。本研究第一部分通过建立高脂喂养胰岛素抵抗的大鼠模型，并给予阿托伐他汀干预治疗，检测主动脉DDAH1、SERBP1蛋白及基因的表达，以及血浆ADMA水平。旨在观察阿托伐他汀对胰岛素抵抗大鼠的DDAH1/ADMA/NO系统的影响，从而评价阿托伐他汀对于胰岛素抵抗状态下血管内皮细胞功能的作用和影响　　方法:30只SD大鼠(200-250g)随机分为2组:1）对照组(CON，N=10):普通饮食喂养。2）高脂饮食组（HFD，N=20）:高脂饮食喂养8周。喂养第8周末，测空腹血糖，胰岛素水平，通过计算HOMA-IR（空腹胰岛素水平×空腹血糖水平/22.5，＞2.69判断为有胰岛素抵抗）评估大鼠胰岛素敏感性。随后高脂喂养组进一步分为2组:胰岛素抵抗+阿托伐他汀治疗组(IR+A，N=10):继续高脂饮食喂养，同时给予阿托伐他汀30mg/kg/d（辉瑞）灌胃8周;胰岛素抵抗组(IR，N=10)，继续高脂喂养8周。实验终点检测血清学指标，Westernblot、Real-timePCR检测主动脉DDAH1、SERBP1蛋白及基因的表达，高效液相色谱法检测血浆ADMA水平。　　结果:胰岛素抵抗组大鼠甘油三酯及C反应蛋白与对照组相比明显增高(分别为1.45±0.41vs.0.9±0.24mmol/L，P＜0.05;0.3±0.1vs0.12±0.1mg/L，P＜0.01)。与胰岛素抵抗组比较，阿托伐他汀组大鼠血甘油三酯、C反应蛋白水平明显降低(分别为0.82±0.3vs1.45±0.41mmol/1,P＜0.01;0.03±0.01vs0.3±0.1mg/L,P＜0.01。)通过高效液相色谱仪（HPLC）测定血ADMA的水平及主动脉DDAH活性，与对照组(CON)相比，胰岛素抵抗组(IR)血浆ADMA水平明显升高，而DDAH活性明显降低，(分别为1.1±0.24vs.0.52±0.1μmol/L,P＜0.01;0.05±0.01vs.0.12±0.01μ/gprotein,P＜0.01)，与胰岛素抵抗组比较，阿托伐他汀组大鼠血浆ADMA水平明显下降，DDAH活性明显升高（分别为0.87±0.22vs.1.1±0.24μtmol/L，P＜0.05;0.07±0.012vs.0.05±0.01μ/gprotein，P＜0.05）。胰岛素抵抗组大鼠HOMA指数较对照组增高(3.06±0.6vs.1.89±0.3，P＜0.05)，而阿托伐他汀可降低胰岛素抵抗大鼠HOMA指数(3.06±0.6vs.2.38±0.5，P＜0.05)。通过Pearson相关性分析发现，HOMA指数与DDAH活性呈明显的负性相关(r=-0.795，P＜0.01)。通过乙酰胆碱诱导的主动脉舒张反应显示，与对照组对比，胰岛素抵抗组大鼠主动脉对乙酰胆碱的舒张反应明显减低，而阿托伐他汀可增强胰岛素抵抗组大鼠主动脉对乙酰胆碱舒张反应。胰岛素抵抗组大鼠主动脉DDAH1，SREBP1蛋白及mRNA水平较对照组均明显下降，而阿托伐他汀可增高DDAH1，SREBP1蛋白及mRNA水平。　　结论:阿托伐他汀可能通过调节DDAH1/ADMA水平改善胰岛素抵抗大鼠内皮功能，而SREBP1作为转录因子，可能介导阿托伐他汀对DDAH1/ADMA的调节　　第二章SREBP1介导阿托伐他汀调控胰岛素抵抗内皮细胞DDAH1/ADMA系统的表达　　背景:DDAH1/ADMA系统与内皮功能紊乱密切相关，前期动物实验发现:胰岛素抵抗状态下DDAH1、DDAH活性，SREBP1表达受抑制，阿托伐他汀作为内皮保护药物，可改善DDAH活性，增加SREBP1表达。为进一步证实阿托伐他汀对胰岛素抵抗状态下内皮细胞DDAH1/ADMA系统调节的可能机制，本研究第二部分通过建立人脐血内皮细胞胰岛素抵抗模型，并采用siRNA转染技术抑制SREBP-1基因表达，旨在观察SREBP1抑制状态下内皮细胞表达DDAH1、ADMA及内皮细胞功能的变化，以评价SREBP1在阿托伐他汀改善血管内皮细胞功能中的作用机制，　　方法:1、高胰岛素培养诱导内皮细胞胰岛素抵抗模型:采用不同浓度胰岛素培养人脐血内皮细胞(HumanUmbilicalVeinEndothelialCells，HUVECs)不同时间（12、24、36和48h）。分析不同浓度胰岛素，不同培养时间对内皮细胞摄取葡糖糖能力的影响，最后选择最佳浓度，最佳培养时间培养内皮细胞建立内皮细胞胰岛素抵抗模型。　　2、采用不同浓度阿托伐他汀(0.05，0.1，1.0，10μmol/L，)分别作用12、24、36和48h，通过分析内皮细胞摄取葡萄糖能力，确定最佳浓度及作用时间。　　3、siRNA转染抑制SREBP1表达:使用LipofectamineTM2000转染siRNA。以250ulOpti-MEM(@)稀释5ulLipofectamineTM2000混匀后在室温下孵育5分钟。以250ulOpti-MEM(@)Ⅰ稀释7.5ulsiRNA，轻轻混匀。孵育5分钟后将混合稀释的siRNA和LipofectamineTM2000混合，并在室温下孵育20分钟，以便允许复合物的形成。溶液可能出现混浊，但是这不会影响转染。将siRNA-LipofectamineTM2000复合物加入培养板中并通过前后摇动培养板使其混合。6小时后进行荧光检测转染率。　　4、实验分组:　　①正常对照组(CON):正常培养HUVECs24小时;　　②胰岛素抵抗组(IR):在含有100nmol/L胰岛素的RPMI1640培养基中培养内皮细胞24小时。　　③胰岛素抵抗+阿托伐他汀治疗组(IR+A):胰岛素抵抗造模成功后换含有10-5mol/L阿托伐他汀的培养基培养24小时。　　④胰岛素抵抗+空白siRNA(IR+scramble):转染空白siRNA载体后在含有100nmol/L胰岛素的RPMI1640培养基中培养内皮细胞24小时。　　⑤胰岛素抵抗+siRNA组-SREBP1(IR+siRNA):转染siRNA-SREBP1后在含有100nmol/L胰岛素的RPMI1640培养基中培养内皮细胞24小时。　　⑥胰岛素抵抗+siRNA+阿托伐他汀组(IR+siRNA+A):转染siRNA-SREBP1后在含有100nmol/L胰岛素的RPMI1640培养基中培养内皮细胞24小时，再用含有10-5mol/L阿托伐他汀的培养基培养24小时。　　5、检测各组内皮细胞SREBP1，DDAH1，DDAH活性，ADMA，NO，NOS水平的表达。　　结果:　　1、内皮细胞置于含1％FBS和100nmol/L胰岛素的RPMI1640培养基中培养24h，细胞消耗葡萄糖最少，即胰岛素抵抗作用最为明显。　　2、阿托伐他汀对胰岛素抵抗内皮细胞表达ADMA和DDAH活性的影响:胰岛素抵抗内皮细胞上清液ADMA水平较对照组明显升高（0.94±0.11vs0.49±0.09u/mmol，P＜0.01），而内皮细胞DDAH活性明显降低（0.052±0.01vs0.158±0.02u/g，P＜0.01）;与胰岛素抵抗内皮细胞相比较，加用阿托伐他汀处理组上清液ADMA水平明显降低（0.59±0.06vs0.94±0.11u/mmolP＜0.01），DDAH活性明显增强(0.11±0.02vs0.052±0.01,P＜0.01)。　　3、阿托伐他汀对胰岛素抵抗内皮细胞SREBP1和DDAH1表达的影响:胰岛素抵抗状态下内皮细胞表达SREBP1，DDAH1蛋白及基因均明显下降，阿托伐他汀干预组内皮细胞表达SREBP1和DDAH1明显增加(P＜0.01)。　　4、siRNA阻断SREBP1基因对内皮细胞DDAH1表达的影响:阻断SREBP1基因表达后内皮细胞表达DDAH1基因和蛋白明显减少(P＜0.01)。　　5、siRNA阻断SREBP1基因对内皮细胞DDAH活性和ADMA系统的影响:阻断SREBP1基因表达后内皮细胞DDAH活性明显降低(P＜0.01)，上清液ADMA增加、NO水平降低。　　6、siRNA阻断SREBP1基因对阿托伐他汀干预的胰岛素抵抗内皮细胞DDAH1表达的影响:阻断SREBP1基因表达后，阿托伐他汀干预的胰岛素抵抗内皮细胞DDAH1基因和蛋白表达明显减(p＜0.01)。　　7、阻断SREBP1基因对阿托伐他汀干预的胰岛素抵抗内皮细胞DDAH活性和ADMA系统的影响:阻断SREBP1基因表达后，阿托伐他汀干预的胰岛素抵抗内皮细胞DDAH活性明显降低(P＜0.01)，上清液ADMA增加、NO水平降低。　　结论:　　1、阿托伐他汀改善胰岛素抵抗内皮细胞SREBP1、DDAH1表达及DDAH活性。　　2、siRNA沉默内皮细胞SREBP1基因，抑制了内皮细胞DDAH1蛋白和基因的表达。　　3、SREBP1介导阿托伐他汀调节胰岛素抵抗内皮细胞DDAH1/ADMA系统的表达。