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背景鼠传疾病是一类由鼠或鼠体寄生虫传播引起的危害人畜健康的重要传染病。鼠类能给人畜传播多种细菌、病毒、病原虫和立克次体等病原体,造成巨大的经济损失和安全隐患。及时准确地检测、鉴定病原体是鼠传疾病疫情防治的关键。传统检测方法如分离培养法、血清学检测法等检测通量小,灵敏度低,而以实时荧光定量PCR法(Real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR)和基因芯片法为代表的核酸分子检测技术虽然提高了检测灵敏度,实现了多重病原检测,但qPCR法因报告基因光谱重叠限制了被检病原种类数;基因芯片法价格昂贵,操作复杂,不利于推广使用。因此,急需建立一种灵敏、简便、高通量的鼠传病原体检测方法。目的本研究旨在建立一种基于QIAxcel毛细管电泳系统的鼠传疾病病原体多重PCR检测方法,将实现在单管中同时检测恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi,Ot)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum,Ap)、莫氏立克次体(Rickettsia typhi,Rt)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis,Ft)、贝氏柯科斯体(Coxiella burnetii,Cb)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans,Lep)和巴尔通体(Bartonella,Bar),并评价该方法的灵敏度、特异性和可重复性。方法1.应用微生物数据分析云平台(https://analysis.mypathogen.org)中“special marker gene”工作流筛选7种病原体特异基因并设计特异性引物。根据TSP(Temperature Switch PCR)原理构建特异性嵌合引物,在反应体系中加入7对特异性嵌合引物和1对通用引物,通过增加通用引物浓度和该阶段反应循环数,使通用引物为主导进行扩增。用阳性菌株核酸检测反应体系的特异性,用不同稀释度的质粒标准品检测反应体系的灵敏度和可重复性。PCR产物经QIAxcel毛细管电泳和琼脂糖凝胶电泳检测。2.将7种阳性菌株核酸与无特定病原体(specific pathogen free,SPF)鼠脾核酸按不同比例混合制成模拟样品,验证多重PCR检测体系的灵敏度。运用多重PCR法检测86份野外鼠脾样品,同时与单重常规PCR法和单重qPCR法检测结果比较,评价该方法的实际应用情况。PCR产物经QIAxcel毛细管电泳检测。结果1.该方法特异性检测均只出现单一目的条带,各病原间无交叉反应。多引物单模板毛细管电泳灵敏度检测下限为11—76 copies/μl,比琼脂糖凝胶电泳检测灵敏度提高10倍;多引物多模板毛细管电泳灵敏度检测下限为20—200 copies/μl,在22×101 copies/μl可检测到 5种病原菌Rt、Ft、Cb、Lep和 Bar,比普通琼脂糖凝胶电泳检测灵敏度提高10倍。在2×102 copies/μ1可检测到7种病原菌。2.多重PCR法检测模拟样品特异性良好,单病原感染样品的灵敏度检测下限为110—104ng/μl,其中Cb、Ft、Bh检测下限低至10-4 ng/μl;多病原感染样品的灵敏度检测下限为10—10 ng/μl,其中Bh、Ft检测下限低至10-4ng/μl,相比单病原感染,多病原感染样品Cb的灵敏度检测能力降低10倍。多重PCR法检测北京市86份野外鼠脾样品结果显示,多重PCR法检测能力与单重qPCR法相当,优于单重常规PCR法。多重PCR法和单重qPCR法对不同病原体的检测能力不同。经检测北京市86份样品感染率为25%,均为单病原感染,其中Bar、Lep和Ap感染率分别为21%、3%和1%。结论本研究运用QIAxcel毛细管电泳系统建立的多重PCR方法可高效、快速、灵敏地同时检测7种鼠传病原菌,为一系列鼠传疾病的早期诊断和监测预防提供了有效手段。