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醋酸菌由于具有较高的醋酸发酵能力和醋酸耐受能力,而常用于醋酸发酵生产。醋酸菌中依赖辅酶PQQ的乙醇脱氢酶(ADH)对乙醇氧化和菌体醋酸耐受性有重要影响。本研究构建了适合巴氏醋杆菌的重组表达载体,实现了 PQQ生物合成蛋白的重组表达,进一步分析了 PQQ与菌体醋酸耐受性和醋酸发酵之间的关系,对进一步完善醋酸菌醋酸耐受机制,提高发酵速率具有一定的科学价值和应用价值。以巴氏醋杆菌AC2005基因组为模版,扩增pqq基因簇,在大肠杆菌中重组表达pqq基因簇,并成功检测到PQQ,而对照菌株中未检测到。说明本论文扩增的巴氏醋杆菌pqq基因簇可以生物合成PQQ。实验以pMV24为载体,gfp为报告基因,筛选出适合大肠杆菌-巴氏醋杆菌重组蛋白表达的穿梭载体pMV24-pl13。构建巴氏醋杆菌重组表达菌株AC2005(pMV24-pl13-pqq),PQQ浓度达到1.85 μg/L,比对照菌株提高了 152.53%,单位菌体ADH和乙醛脱氢酶(ALDH)的催化活性分别提高52.92%和67.04%。分析了 PQQ合成蛋白重组表达对巴氏醋杆菌生长和醋酸耐受性的影响,在1%醋酸条件下,重组菌的生长与对照菌AC2005(pMV24)相比没有差异,在2%醋酸条件下培养48 h,与对照相比重组菌生物量提高了 182.50%,3%以上醋酸抑制作用增强,但重组菌表现了更好的醋酸耐受性,3%和4%醋酸浓度条件下,比对照相菌生物量分别提高23.40%和13.80%。用4%、6%的醋酸分别处理40 min后,与对照相比,重组菌的存活率分别提高30.70%和76.20%。分析了 PQQ合成蛋白重组表达对醋酸发酵的影响,与对照相比,7%初始乙醇浓度条件下,重组菌发酵产酸提高1 6.96%;利用RT-PCR的方法分析了重组表达PQQ合成蛋白对菌体乙醇氧化和醋酸耐受性相关蛋白表达的影响,结果表明,重组表达PQQ合成蛋白对ADH、ALDH、柠檬酸合酶(CS)、分子伴侣DnaK等蛋白表达没有显著促进作用;利用5 L自吸式发酵罐进行发酵试验,8%初始乙醇浓度条件下,重组菌的发酵速率达到1.57 g/(L.h),与对照相比提高了 21.71%。证明重组表达PQQ合成蛋白主要通过提高辅酶PQQ浓度,从而提高ADH催化活性,最终提高菌体醋酸耐受性和发酵速率。