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第一部分Syt7在胃癌组织中的表达及与患者临床特征之间的关系目的:检测胃癌组织及胃癌癌旁组织中Synaptotagmin 7(Syt7)的表达情况,并分析Syt7表达水平与胃癌的关系。方法:1.收集苏州大学附属第一医院2015年1月至2018年12月手术切除的胃癌及胃癌癌旁组织的石蜡标本112例,通过免疫组化检测Syt7蛋白的表达。2.对免疫组化的染色结果进行染色评分。3.分析Syt7表达水平与患者年龄、性别、原发肿瘤分化程度及是否转移的相关性。结果:1.免疫组化染色显示Syt7蛋白在细胞膜及胞浆中染色,胃癌组织标本中的阳性表达率为71.4%(80/112),在胃癌癌旁组织中阳性表达率为5.4%(6/112)。其在胃癌组织标本中的阳性表达率明显高于胃癌癌旁组织中的阳性表达率,结果具有统计学意义(P<0.01)。2.Syt7蛋白在胃癌组织标本中的表达评分与性别、年龄均无相关性(P>0.05)。3.Syt7蛋白在胃癌组织标本中的表达评分与是否转移显著相关,胃癌伴有转移的组织标本免疫组化评分显著高于无转移组(P<0.01)。4.Syt7蛋白在胃癌组织标本中的表达评分与肿瘤分化程度相关,胃癌分化程度越低,免疫组化评分越高(P<0.05)。结论:1.胃癌组织Syt7蛋白表达明显高于癌旁组织。2.胃癌患者Syt7蛋白表达与性别、年龄无关;与原发肿瘤分化程度及是否发生转移密切相关。第二部分 Syt7对胃癌细胞功能的影响及调控胃癌细胞增殖凋亡的机制研究目的:检测Syt7在胃癌细胞株SGC-7901、BGC-823、MGC-803、AGS中的表达情况,并且探究敲除Syt7后胃癌细胞株AGS、MGC-803体外生长、增殖、凋亡、克隆、细胞周期和侵袭、迁移的影响,并初步探讨可能的作用机制。方法:1.采用实时定量 PCR(qPCR)检测 SGC-7901、BGC-823、MGC-803、AGS4株胃癌细胞株Syt7mRNA的表达丰度。2.构建Syt7基因的RNA干扰慢病毒载体,Syt7RNA干扰慢病毒转染胃癌细胞AGS、MGC-803,分为对照组(shCtrl)和实验组(shSyt7),运用qPCR和Western Blot检测干扰后Syt7mRNA和蛋白的表达,证实克隆成功,Celigo细胞计数检测shCtrl和shSyt7两组细胞的生长情况,绘制增殖曲线;MTT法检测shCtrl和shSyt7组细胞的增殖情况,酶标仪490/570 nm检测OD值;克隆实验检测shCtrl和shSyt7两组细胞的成瘤能力。3.Syt7RNA干扰慢病毒转染细胞AGS、MGC-803后,流式细胞仪分析shSyt7和shCtrl两组细胞凋亡及细胞周期的情况,Transwell检测shSyt7和shCtrl两组细胞的侵袭和迁移能力。4.敲除Syt7,酶测定法检测胃癌AGS细胞实验组及对照组Caspase3/Caspase7的活性,免疫印迹(Western Blot)检测β-catenin、VE-cadherin、E-cadherin、MMP-9、K-ras、PIK3R1、bcl-2、STAT1、p53、STAT3 蛋白的表达情况。结果:1.qPCR结果显示:BGC-823、MGC-803、AGS 3种细胞株中Syt7mRNA的表达丰度为高,SGC-7901表达丰度为中。2.成功构建了 Syt7干扰慢病毒载体,建立了稳定干扰Syt7的AGS、MGC-803细胞系;慢病毒转染后,AGS、MGC-803细胞中的Syt7mRNA表达量受到明显抑制(P<0.05),Western Blot显示慢病毒转染对Syt7的蛋白表达水平有显著的抑制作用;通过Celigo分析仪连续观察5天,结果发现,shSyt7组细胞的生长受到明显抑制(P<0.05);MTT检测转染三天后shSyt7组具有活力的细胞数明显减少(P<0.05);克隆实验结果发现,shSyt7组细胞的集落数目显著减少(P<0.05),提示干扰Syt7细胞增殖减缓,克隆形成的能力显著降低,并且随着时间的延长,差异越明显。3.慢病毒转染AGS、MGC-803细胞后5天,shSyt7组细胞的凋亡数增多(P<0.05),处于G1期细胞减少,S期细胞增多(P<0.05),差异均有统计学意义,提示Syt7可干扰细胞周期。4.慢病毒干扰Syt7后,发现shSyt7迁移细胞数明显较少(P<0.05),差异有统计学意义。5.慢病毒转染AGS细胞,shSyt7组Caspase3/7活性明显增加(P<0.05)。与对照组比较,STAT1、p53、E-cadherin表达增强,而 β-catenin、VE-cadherin、MMP-9、K-ras、PIK3R1、bcl-2、STAT3 表达减弱,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:1.在胃癌细胞株BGC-823、MGC-803、AGS中Syt7mRNA高表达,沉默Syt7基因抑制了胃癌细胞AGS、MGC-803生长增殖、克隆形成,促进其凋亡,这可能与Syt7调节线粒体途径和死亡受体途径诱导胃癌细胞的凋亡密切相关;2.沉默Syt7基因诱导胃癌细胞周期明显阻滞于S期,导致细胞周期停滞,细胞侵袭和迁移能力明显下降,这可能与调控多条信号通路(P13K/AKT信号通路、p53信号通路、Wnt/β-catenin 信号通路、Ras-MEK-ERK 通路、JAK/STA 通路)有关。