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鸡传染性支气管炎（IB）是由禽γ-冠状病毒引起的一种急性接触性传染病,该病给养禽业带来极大的危害并造成严重的经济损失。长期流行病学监控及针对流行毒株的疫苗研发对于该病的防控具有重要的意义。本论文旨在研究中国不同时期鸡传染性支气管炎病毒（IBV）分离株基因型构成及其发生、发展变迁规律与趋势;构建IBV H120疫苗株感染性克隆并进行基因替换、插入等修饰及病毒拯救,快速制备针对流行毒株的IB疫苗候选毒株及开发IBV载体疫苗。第一部分:中国鸡传染性支气管炎病毒基因型变迁规律2016-2019年本实验室从15个省份黄羽肉鸡和种鸡群中分离鉴定IBV203株并进行S1基因测序。将所得序列与Gen Bank中下载的中国IBV分离株S1基因1700条一起整理,划分为5个时间段进行进化分析,构建系统发生树。通过不同时期分离株基因型比较和分析,研究发现中国大陆地区IBV广泛流行始于1980年之后,流行史上至少出现了13个进化分支和少量变异株进化分支。这些进化分支中,GI-19、GI-22、GI-7、GVI-1分支起源于我国。GI-19分支毒株出现时间不晚于1993年,2000年以后成为中国最主要的优势基因型,占分离毒株50%以上,在各省及不同年份均有分离,在时间和地理分布方面没有明显的倾向。GI-22分支是我国早期出现的进化分支,早期毒株出现于1995-1999年间,近年来该分支毒株分离数量和所占比例出现了下降趋势。GI-7分支起源于我国台湾地区,早期毒株可追溯至1964年,1990年后分化为TW I和TW II两个亚分支,2009年之前,大陆地区仅分离少数TW II型,2009年后,大量TW I型毒株被分离鉴定,并成为主要流行基因型。GVI-1分支毒株于2007年首次分离,该型毒株S1与其他分支毒株差异较大,虽持续分离,但分离总数量少,地理分布范围局限。GI-1和GI-13分支源自广泛使用的国外引入的Mass型疫苗株和4/91型疫苗株,这两个分支毒株在我国广泛分布,也是我国主要的流行基因型。GI-4、GI-5、GI-6、GI-9、GI-16、GI-18和GI-23型毒株均起源于国外,其中国分离株数量稀少,仅在局部地区或某个时期分离,并未引起广泛爆发与流行。研究提示我们我国IBV流行处于不断动态变化中,应加强IBV分子流行病学监控,掌握基因变异变化趋势;疫苗研发应立足于本土流行毒株,迫切需要快速有效的新技术和方法。第二部分:传染性支气管炎病毒H120株感染性克隆构建与病毒拯救利用RED/ET重组工程技术成功构建基于中拷贝质粒载体p BR322的IBV疫苗H120株感染性克隆p BR322-H120及其病毒拯救系统。利用该系统成功拯救病毒r H120,拯救病毒传代稳定,经鉴定生物学特性与母本病毒H120一致。第三部分:传染性支气管炎病毒H120株感染性克隆修饰与重组病毒拯救本研究利用RED/ET重组技术结合ccd B反向筛选对感染性克隆p BR322-H120进行同源S1、S和N基因替换,外源基因EGFP、H9N2 AIV HA基因、ILTV g D基因的插入/替换修饰。同源基因替换采用QX型IBV GL15株和TW I型IBV GZ14株作为基因供体,设计三种S1基因、两种S基因、两种N基因长度及位置替换方式,在此基础上设计了GZ14 S1和N双基因替换,GL15株和疫苗4/91株嵌合S基因替换,构建成功14种重组质粒,成功拯救出9株重组病毒。外源基因替换/替换方面,利用IBV复制非必须区5ab、3ab和IR区作为外源基因替换/插入位点,以绿色荧光蛋白EGFP基因、ILTV g D基因和截短的H9N2 AIV HA基因（900 bp）作为基因供体,对感染性克隆p BR322-H120进行替换/插入修饰,成功构建出9种重组质粒,经病毒拯救,获得重组病毒r H120-△5ab/EGFP、r H120-△IR/EGFP、r H120-△IR/Flag-ILTV g D和r H120-△5ab/Flag-h H9HA（900 bp）。对拯救病毒的生物学特性研究发现,9株同源基因替换的重组病毒传代稳定,病毒滴度与母本病毒H120株无显著性差异（P＞0.05）。4株替换/插入外源基因的重组病毒均可表达外源蛋白,但病毒滴度低于亲本毒株。九株同源基因替换的重组病毒进行动物实验,筛选出两株TW I型疫苗候选毒株:r H120-△S1p/GZ14和r H120-△S1z-△Nz/GZ14,三株QX型疫苗候选毒株:r H120-△S1p/GL15、r H120-△Sp/GL15和r H120-△Sp/GL15-4/91。本研究对我国IBV流行情况进行回溯,总结我国各时期IBV主要流行基因型及其起源、发生和发展,为IBV分子流行病学研究和防控提供参考。本研究成功构建IBV疫苗H120株感染性克隆,在此基础上进行同源基因或外源基因插入/替换等反向遗传操作,并成功拯救重组病毒。该系统和方法具有快速构建、修饰方便、高效筛选等特点,为冠状病毒反向遗传构建和修饰、IBV载体疫苗研制提供一种新的方法和策略。