副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)为嗜盐菌,主要存在海水水域、海底生长物、淤泥和鱼、虾、贝类海产品中。其主要通过鲜活鱼虾、贝类、未充分熟透的海产品或生熟未分开交叉污染进行致病菌的传播,可引起食源性肠胃炎。长期以来,副溶血性弧菌的检测多用定性方法,多数采用传统的细菌学MPN(most probable number最大可能数)法或平板法定量检测技术。本研究用MPN-PCR(polymerase chain reaction,聚合酶链式反应)、PMA(propidium monoazide,叠氮溴化丙锭)-PCR和数字PCR方法对厦门多个地区海产品、贝类中生蚝和毛蚶的副溶血性弧菌的毒力因子污染水平进行定量检测。通过MPN-PCR方法检测副溶血性弧菌的tlh(thermolabile hemolysin不耐热溶血毒素)、tdh(thermostable direct hemolysin,耐热直接溶血素)和ORF8(开放读码框Open Reading Frame)基因,tlh、tdh和ORF8基因MPN值为3～>1100MPN/g,trh(thermostable direct hemolysin-related hemolysin,溶血相关溶血素)稍微偏低,为3～43MPN/g。在毛蚶样本中,tlh均为阳性,MPN值为7.2～>1100MPN/g,trh检出率最低,达到3～11MPN/g。其中,tdh基因在生食水产品和环境样本中较少检出,整个检测过程包括样品处理、增菌培养和扩增反应,总用时不超过24h,初步实现了对副溶血性弧菌毒力因子的快速定量检测。本研究利用具有良好特异性的tox R基因作为检测靶基因,建立了荧光PCR定量方法,发现在细菌菌悬液中加入终浓度为10mg/L的PMA时,可有效抑制副溶血性弧菌死菌(2×10~6CFU/m L)的DNA扩增;而PMA浓度小于或等20 mg/L时,对副溶血性弧菌相关基因的扩增没有显著的影响;同时,加入PMA后,随着在死菌和活菌的混合液中活菌的比例逐渐提高,反应体系圹增与阳性对照相比,表现出显著的抑制作用(P<0.05),说明PMA染料能不影响活菌而有效抑制副溶血性弧菌菌悬液中死菌基因的扩增。该方法将目前致病菌定量检测时间由5～6d缩短至3h,灵敏度达到20 CFU/m L,特异性达到99%。在数字PCR检测技术的研究中,从培养后的增菌液取样提取核酸后进行油包水、微滴化生成、PCR反应和微滴计数,整个检测过程不超过72h,可直接得出毒力因子最多阳性拷贝数达到7500个拷贝数,最低低至4个拷贝数,可以推断出原始模板中每个单元的拷贝数在33750左右,整个微滴检测过程不需要标准样进行相对定量分析,可直接对样品中死菌和活菌进行定量检测。以上结果表明,综合采用MPN-PCR、PMA-PCR和数字PCR法可以高效定量测定海产品中副溶血性副溶血性弧菌的总量、毒力因子及其死、活菌数量,为定量检测该菌的污染提供了方法参考。