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目的:探索正常小鼠针刺后血清外泌体（Acupunctuer-exosome,Acu-exo）腹腔注射对缺氧小鼠生存时间的影响及其起效的可能靶标,为针灸基础研究转化及中医治未病提供实验依据。方法:研究内容一电针足三里预处理对缺氧小鼠生存时间的观察研究本实验重复2次,第一次实验,将32只正常KM种雄性小鼠随机分为空白对照组、电针组,每组16只。电针预处理以针灸针（0.25×13 mm）刺入足三里穴（3-5mm）,电针参数为:频率10Hz,疏密波,时间15min,强度为5。电针结束后即刻将小鼠放入装有30g钠石灰的250m L广口瓶中,造成缺氧环境,以小鼠生存时间为观察指标。对照组不针刺仅进行缺氧模型复制。第二次实验,将30只正常KM种雄性小鼠随机分为空白对照组、电针组,每组15只。其余操作同第一次实验。研究内容二Acu-exo对缺氧小鼠生存时间作用规律的研究1.正常小鼠电针足三里穴不同天数后Acu-exo的提取与鉴定将32只正常KM种雄性小鼠随机分为空白对照组（E0）、电针1天组（E1）、电针4天组（E4）及电针7天组（E7）,每组8只,频次:1次/1天,参数同前。各组针刺后眼球取血,运用Exo Quick法于血清中提取Acu-exo,通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、蛋白质免疫印迹法对外泌体大小及形态、标志物进行鉴定。2.注射溶剂PBS、DMSO对缺氧小鼠生存时间的观察研究将18只正常KM种雄性小鼠随机分为空白对照组、PBS组、DMSO组,每组6只。PBS组运用无菌PBS（0.1m L/10g）对正常小鼠进行腹腔注射,于0.5h后,复制缺氧模型;DMSO组运用DMSO（浓度为0.2%,0.1m L/10g）对正常小鼠腹腔注射,于1.25h后复制缺氧模型,以小鼠生存时间为观察指标。3.回输Acu-exo对缺氧小鼠生存时间的观察研究将50只正常KM种雄性小鼠随机分为空白对照组、回输E0外泌体组、回输E1外泌体组、回输E4外泌体组、回输E7外泌体组,每组10只,回输的各组外泌体,即实验1中提取E0、E1、E4、E7的外泌体,各组进行Acu-exo（4mg/kg,0.1ml/10g）腹腔注射,0.5h后,复制缺氧模型,以小鼠生存时间为观察指标。4.拮抗循环外泌体对缺氧小鼠生存时间的观察研究将40只正常KM种雄性小鼠随机分为空白对照组、电针组、电针+DMSO组、电针+GW4869组,每组10只。电针组进行电针干预,电针预处理以针灸针（0.25×13 mm）刺入足三里穴（3-5mm）,电针参数为:频率10Hz,疏密波,时间15min,强度为5。电针+DMSO组、电针+GW4869组分别进行腹腔注射DMSO（浓度为0.2%,0.1m L/10g）及GW4869（使用外泌体拮抗剂GW4869溶解于DMSO中,3mg/m L,0.1m L/10g）,1小时后,将小鼠进行电针预处理,电针参数同前。电针干预后即刻复制缺氧模型,以小鼠生存时间为观察指标。研究内容三Acu-exo提高缺氧生存时间作用机制的复杂网络分析运用非靶标定量蛋白组学技术（Label Free）测量对照组与正常针刺组提取血清外泌体所运载蛋白的种类和含量,筛选组间变化倍数大于1.5,p<0.05的针刺显著差异蛋白,将筛选出的263个正常针刺显著差异蛋白作为源数据,将显著差异蛋白运用Uniport蛋白数据库进行基因转换和HGNC人类基因组数据库进行基因映射为人类基因。运用OMIM数据库、Dis Ge NET数据库、Genecards数据库中筛选出与缺氧相关的人类基因,取两者交集筛选出共有靶标基因。再运用DAVID数据库对共有的靶标进行KEGG通路和GO功能数据库的建立,通过Gephi软件等构建显著差异靶标-KEGG通路网络连入图、显著差异靶标-KEGG通路网络连出图、显著差异靶标-GO功能网络连出图、气泡图,联合应用连入度、连出度等数据挖掘算法,筛选针刺后提取血清外泌体（Acu-exo）耐缺氧效应的可能作用靶标。结果:1.电针预处理可以提高缺氧小鼠的生存时间电针预处理后进行缺氧模型复制,重复2次实验,第一次实验,空白对照组生存时间:32.61±2.96min;电针组生存时间:50.84±3.89min。第二次实验,空白对照组生存时间:37.73±4.00min;电针组生存时间:50.35±6.35min,重复两次实验结果相似,电针组较对照组的生存时间明显提高,具有统计学差异（P<0.01）。2.外泌体的形态、大小及标志物符合细胞外囊泡协会鉴定的要求和标准将空白对照组（E0）、电针1天组（E1）、电针4天组（E4）、电针7天组（E7）提取的Acu-exo进行BCA蛋白浓度测定,E0、E1、E4和E7组的蛋白浓度为9.19mg/m L,11.22mg/m L,10.74mg/m L,15.69mg/m L。透射电镜检测显示,外泌体直径≥30,≤200nm,其中血清外泌体均呈圆形、类圆形囊泡的形状,或单个分布,或聚集成群。纳米颗粒跟踪分析发现E0、E1、E4和E7各组检测报告表明MODE曲线线性流畅,提示含有杂质少,粒径峰值分别为67.6nm、103.3nm、72.4nm和137.9nm,粒径峰值与理论外泌体尺寸值（30-200nm）相符。利用SDS-PAGE电泳分析E7组外泌体蛋白谱有条带,电泳显示蛋白条带CD63、CD9、Tsg101和Clanexin符合标准,提示提取外泌体未受杂蛋白干扰,纯化效果佳。3.溶剂PBS、0.2%DMSO对电针提高缺氧小鼠生存时间无明显影响空白对照组生存时间:33.25±2.38min;PBS组生存时间:34.22±3.19min;DMSO组生存时间:37.55±5.69min。对照组、PBS组、DMSO组缺氧小鼠生存时间无明显差异。4.腹腔回输Acu-exo可提高耐缺氧小鼠的生存时间空白对照组生存时间:33.29±2.84min;回输E0外泌体组生存时间:34.99±3.59min;回输E1外泌体组生存时间:38.00±4.22min;回输E4外泌体组生存时间:39.59±3.77min;回输E7外泌体组生存时间:40.94±2.70min。回输E1外泌体组、回输E4外泌体组、回输E7外泌体组的耐缺氧时间与空白对照组相比,具有统计学差异（p<0.01）;空白对照组与回输E0外泌体组的耐缺氧时间相比没有显著提高,不具有统计学差异（p>0.05）;回输E1外泌体组、回输E4外泌体组、回输E7外泌体组对小鼠耐缺氧时间有一定上升趋势。5.GW4869拮抗循环外泌体降低了电针提高耐缺氧小鼠生存时间的疗效空白对照组生存时间:29.88±2.35min;电针组生存时间:46.23±4.99min;电针+DMSO组生存时间:46.97±4.76min;电针+GW4869组生存时间:31.41±3.36min;针刺组与电针+GW4869组生存时间相比有显著提高,具有统计学差异（p<0.01）;电针组小鼠的耐缺氧时间与对照组相比有显著提高,具有统计学差异（p<0.01）;电针+GW4869组小鼠的耐缺氧时间与空白对照组相比没有明显差异。6.Acu-exo运载的表皮生长因子受体（EGFR）、血小板反应素-1（THBS1）、凝血因子II（F2）可能是针刺耐缺氧的有效靶标正常电针组与对照组血清外泌体显著差异蛋白映射人类基因有221个,OMIM数据库、Dis Ge NET数据库、Genecards数据库中与缺氧相关人类基因有6104个,共有基因有114个;复杂网络分析发现针刺后提取血清外泌体运载与缺氧相关的可能起效靶标以表皮生长因子受体（EGFR）、血小板反应素-1（THBS1）、凝血因子II（F2）为主。结论:1.Acu-exo可提高缺氧小鼠的生存时间,存在一定的量效规律。2.外泌体在电针提高缺氧小鼠生存时间中发挥重要作用。3.外泌体运载的EGFR、THBS1、F2可能是电针抗缺氧的起效靶标物质。