【研究背景及目的】肝脏具备强大而高效的再生能力,急性肝损伤后剩余的正常组织可通过代偿性肥大快速恢复部分肝脏质量,随即剩余组织中的成熟肝细胞进入细胞增殖周期进行再生修复。但持续暴露于多种代谢、毒性和炎性损伤时,肝脏可能发生系统性损伤反应,导致整体肝细胞损伤和肝细胞自我更新功能受损,特别在长期慢性损伤中,如病毒性肝炎、代谢性肝病、酒精性肝病等不同原因均可能引起的肝纤维化,乃至进一步发展为肝硬化。其中,纤维化进程可归纳为两个不同的损伤修复阶段,一个为细胞再生阶段,受损细胞完全被相同细胞替代;另一个为纤维化阶段,慢性炎症损伤及细胞坏死可导致持续性纤维母细胞激活,促进组织纤维化形成。在慢性炎症损伤的微环境下,再生细胞来源缺乏将促使纤维化形成,这提示在控制纤维化过程中,不仅需调控炎症反应过程,同时应补充具有相同功能的细胞替代受损细胞,重塑纤维化区域的再生平衡。肝脏处于慢性炎症微环境下,大量肝前体细胞活化增殖,尽管其来源尚不明确,但其体外显示增殖能力及双向分化为肝细胞和胆管上皮细胞的能力,将可能成为肝损伤修复的重要来源。基于此,本研究旨在探索在肝脏损伤修复过程中,活化的肝前体样细胞所发挥的重要的肝再生作用,并希望通过外源细胞移植或小分子注入以调控体内肝再生通路的方式,补充肝前体细胞,提高其功能以促进肝再生,改善肝纤维化和肝硬化。【实验方法】本团队前期通过筛选一系列小分子化合物组合的形式(TEM增殖培养基),成功在体外实现原代肝细胞持续的增殖,通过转录组测序及生物信息学分析发现,肝细胞来源的可增殖细胞具备肝前体细胞的特性,并高表达前体标志物CD24,这种增殖的细胞我们命名为HepLPCs。基于此,我们采用免疫荧光,流式细胞术、PCR及Organoid形成实验等检测手段验证HepLPCs体外的增殖功能、自我更新更能及肝胆双向分化潜能;然后通过慢病毒敲低系统降低HepLPCs中CD24的表达,验证其对其的增殖及自我更新能力的影响;进一步建立CCL4诱导慢性肝纤维化模型,通过移植HepLPCs体内验证其在体内对纤维化的治疗作用;然后我们将TEM培养基中HGF与小分子Y-27632,A-83-01和CHIR99021(HACY)组合使用,以检测其在CCL4诱导慢性肝损伤中诱导内源性CD24~+HepLPC补充及对肝纤维化的预后影响;最后我们在人纤维化肝脏样本中分离出来的原代肝细胞体外三维模型中检验小分子组合HACY对内源性CD24~+HepLPC是否同样具有诱导作用。【实验结果】本研究结果显示在TEM培养基条件下,成熟肝细胞来源的HepLPCs高表达CD24、Hnf4α及CK19,并可以在Matrigel基质胶中自发形成两种不同类型的Organoid,并具有成熟肝细胞和胆管上皮细胞的相关功能;其中CD24的表达对HepLPCs在体外培养的条件下的增殖功能具有重要作用;进一步我们研究发现,成熟肝细胞来源的CD24~+HepLPCs在慢性肝纤维化的治疗中表现出明显的效果,可有效缓解损伤状态及逆转纤维化水平;另一方面我们在小鼠体内运用筛选的小分子组合处理后,可以在纤维化肝脏中诱导内源性CD24~+HepLPCs,并有效促进肝纤维化缓解;最后我们通过同样的小分子组合,在人纤维化肝脏样本中分离出来的原代肝细胞体外三维模型中,成功诱导表达CD24~+细胞亚群。【结论】CD24~+HepLPCs对于慢性肝损伤过程中的肝脏再生与功能修复至关重要。体内注射HACY诱导内源性CD24~+HepLPCs可有效缓解肝纤维化进展。本项研究通过运用可溶性小分子组合诱导内源性肝细胞来源的肝前体样细胞(HepLPCs),为干细胞移植治疗慢性肝损伤提供了新的思路和替代治疗方案。