β-伴大豆球蛋白是大豆主要过敏原之一,它能使机体产生过敏反应,并引发一系列过敏症状危害人体健康。β-伴大豆球蛋白是由α、α’和β三个亚基组成的三聚体结构,经研究发现β亚基同样具有致敏性,按照抗原蛋白质内部结构的差异可将其抗原表位分成构象型和线型表位。当前,对抗原表位的研究多为B细胞线型表位,由于蛋白质空间结构的复杂性,所以对构象型表位的预测存在一定的局限。因此,本研究利用生物信息学技术分析方法并结合噬菌体展示技术对超高压处理导致β亚基抗原性降低的亚分子结构进行预测和定位,成功鉴定出β亚基的主要破坏构象表位区域。并结合偶联多肽反应,经Dot-blot试验得知偶联多肽与抗体反应为阴性,表明该片段区域仅为构象型抗原表位。该研究对探明β-伴大豆球蛋白β亚基致敏性的分子机制、开展无过敏和低过敏的食品研究、防止食物过敏疾病的发生以及过敏性疾病的诊断提供了理论和实践依据。主要研究内容如下:1.利用实验室提取的β-伴大豆球蛋白对新西兰兔进行四次免疫,制备β-伴大豆球蛋白多克隆抗体,并利用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化多抗血清。经免疫学实验表明,多克隆抗体的效价为1:1.6×10⁴,IC₅₀为1.58μg/m L,纯化后抗体经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明血清纯度得到提高,而效价及敏感性无明显变化,与大豆Gly m Bd 28K蛋白和花生蛋白的交叉反应率分别由25.28%、1.16%降至为0.79%、0.2%,与麦朊蛋白和芝麻蛋白的交叉反应率均低于0.1%。2.利用生物信息学软件SWISS-MODEL对大豆主要过敏原β-伴大豆球蛋白β亚基建立出三级结构模型,并根据DiscoTope 2.0服务器预测出该模型的构象表位相关区段,采用overlapping分段克隆方式设计出三组片段引物,利用PCR技术扩增目的基因全长及三个互相重叠的片段（A、B、C）将其连接至pMD18-T载体,并转化到大肠杆菌感受态JM109。经蓝白斑筛选,以及对重组质粒进行PCR和双酶切验证,测序结果与设计的基因序列一致。重组质粒经双酶切后与T7噬菌体载体相连接,经体外包装后展示在噬菌体表面,通过ELISA检测筛选得到超高压破坏β亚基的主要抗原区域。本实验通过3轮重复筛选,最后得到氨基酸序列³⁷⁸DNVVRQIERQVQELAFPGSAQD⁴⁰⁰为抗原破坏主要位点区域。3.实验根据抗原破坏位点区域氨基酸序列特点,设计出一条多肽链,合成多肽和BSA偶联后与原多克隆抗体进行Dot-blot试验,结果显示经实验室提取的β-伴大豆球蛋白和各片段重组噬菌体呈阳性反应,与合成多肽及空白对照反应为阴性,即实验结果表明该序列为超高压破坏抗原构象位点。