贾第虫（Giardia duodenalis）是一种危害严重的人兽共患寄生性原虫,由其寄生于人和哺乳动物肠道内引起的贾第虫病是一种重要的人兽共患病。贾第虫包囊经口进入宿主肠道后脱囊形成滋养体,是导致炎性腹泻的重要病原。贾第虫还是艾滋病患者、癌症患者等免疫力低下人群的致死性因素。贾第虫病防控主要依靠甲硝唑等化学药物,存在致畸致癌风险,尚无有效疫苗。近年来,随着贾第虫耐药性问题加剧,迫切需要寻找新的防治贾第虫病的靶标。天然免疫系统是机体抵抗病原感染的第一道防线。模式样识别受体（PRRs）广泛分布于多种免疫细胞,通过识别多种类型病原相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）,激活天然免疫系统。膜结合型受体Toll-like receptors（TLRs）TLR2参与识别贾第虫滋养体,调控宿主炎性应答,但参与这一过程的关键分子尚不清楚。胞内型NLRs受体主要表达于免疫细胞,具有传导NF-κB激活或者分泌促炎因子IL-1β和IL-18的特点。作为胞外病原的贾第虫,鲜有胞内NLRs调节的免疫应答相关研究。贾第虫能否递送生物活性物质进入宿主细胞激活NLRs?细胞外囊泡（extracellular vesicles）富含多肽、蛋白质、脂质和核酸,是介导细胞间通讯的重要生物分子。寄生虫EVs能够介导虫体之间的信息传递以及虫体和宿主之间的信息传递。贾第虫是否分泌胞外囊泡,胞外囊泡能否参与宿主与虫体之间的信息传递,进而调控宿主免疫应答?本课题首先分离鉴定贾第虫胞外囊泡（GEVs）,从GEVs诱导小鼠巨噬细胞细胞炎性应答角度研究,分析参与这一过程的关键炎性小体及其激活的分子机制;并分析GEVs中的蛋白质组份信息,确定激活NLRP3炎性小体的单分子;最后通过动物试验,确定GEVs关键分子介导的NLRP3炎性小体激活对虫体感染的影响,进一步揭示其在贾第虫致病中的作用。1)GEVs刺激小鼠巨噬细胞模型建立。超速离心富集贾第虫滋养体分泌的GEVs,透射电镜下呈典型“杯状”结构,粒径大小为150 nm;激光共聚焦观察GEVs能够被宿主细胞主动吞噬进入胞内,并呈现时间依赖性;荧光定量PCR和ELISA实验测定GEVs能够激活小鼠腹腔巨噬细胞炎性应答,并引起多种炎性细胞因子和趋化因子转录及分泌水平升高,且呈现剂量依赖性。结果表明贾第虫能够分泌GEVs,且可以进入宿主细胞内激活宿主细胞炎性应答。2)GEVs激活宿主小鼠巨噬细胞PRRs分子类型鉴定。GEVs刺激小鼠腹腔巨噬细胞后引起多种NLRs和TLRs转录水平升高,其中NLRP3和TLR2升高最为显著;GEVs刺激使NLRP3受体呈现点状激活并聚集于细胞核周围、TLR2受体大量表达于细胞膜上;通过钾离子外流和溶酶体损伤途径阻断NLRP3受体和阻断TLR2受体均可以显著下调多种炎性细胞因子和趋化因子转录水平、多种炎性细胞因子分泌水平和IL-1βp17蛋白表达水平。结果表明GEVs通过激活宿主TLR2和NLRP3信号通路调控宿主巨噬细胞炎性应答。3)GEVs激活小鼠巨噬细胞炎性小体第二信号的研究。GEVs刺激小鼠腹腔巨噬细胞引起NLRP3炎性小体关键蛋白基因转录水平升高,在感染后6 h～24 h范围内caspase-1 p20的活化和IL-1βp17的分泌呈现先升高到12 h达到峰值然后降低的趋势,在12.5μg～25μg范围内caspase-1 p20的活化和IL-1βp17的分泌呈现剂量依赖性升高;通过阻断钾离子外流途径、溶酶体损伤途径、caspase-1活化途径、泛caspase-1激活途径阻断NLRP3炎性小体激活,可以不同程度下调IL-1β的基因转录、蛋白分泌和表达,且溶酶体损伤途径和泛caspase-1途径更为显著;阻断IL-1β后能够显著下调其它炎性细胞因子IL-6和TNF-α的转录和分泌水平。结果表明GEVs能够通过溶酶体损伤途径激活宿主NLRP3炎性小体,调控IL-1βp17的分泌并介导宿主炎性应答。4)GEVs激活小鼠巨噬细胞炎性小体第一信号的研究。GEVs刺激小鼠腹腔巨噬细胞和THP-1细胞均能促进贾第虫介导的NLRP3炎性小体第一信号pro-IL-1β和其它炎性因子IL-6/TNF-α的转录和分泌;GEVs刺激宿主细胞,在0h～4 h内,引起p38在2 h磷酸化水平达到峰值、ERK和AKT在4 h磷酸化达到峰值,阻断p38和ERK通路可以显著下调IL-1β和其它炎性因子IL-6/TNF-α的转录和分泌,而阻断AKT通路可以显著上调这些炎性因子的转录和分泌;GEVs刺激宿主细胞,可引起NF-κB p65入核,在0 h～4 h内,引起p-p65和p-IKKαβ均在1 h磷酸化水平达到峰值而T-IκBα降解至最低水平,阻断IκBα磷酸化来抑制NF-κB通路可以显著下调NLRP3炎性小体第一信号IL-1β和其它炎性因子IL-6/TNF-α的转录和分泌。结果表明GEVs能够促进贾第虫介导的NLRP3炎性小体第一信号激活,这一过程依赖于p38、ERK、NF-κB的正调节和AKT的负调节,而且p38、ERK、AKT、NF-κB信号通路参与了GEVs介导宿主炎性应答。5)GEVs激活小鼠炎性小体关键分子筛选和功能研究。蛋白质组学分析GEVs蛋白大小介于18.4 k Da～116 k Da范围,且在66 k Da处集中,酶解后共鉴定出153种蛋白,399种肽段,与贾第虫数据库匹配到131个已知蛋白,包括参与EV生成、贾第虫致病等的关键蛋白,参与129条信号通路,包括:核糖体、糖酵解、NOD样受体、MAPK、PI3K-AKT、TOLL通路等;初步筛选到多种贾第素可以引起caspase-1 p20活化,Alpha-2贾第素和Alpha-7.3贾第素可以上调NLRP3炎性小体关键蛋白表达、caspase-1活化、IL-1β分泌,使得凋亡相关斑点样蛋白（ASC）寡聚化、ASC蛋白呈speck状、NLRP3蛋白呈点状聚集;Alpha-2贾第素和Alpha-7.3贾第素可以通过激活宿主NLRP3炎性小体引起IL-1β分泌;阻断NLRP3炎性小体,使得小鼠在感染初期体重显著减少、十二指肠滋养体数量显著升高、肠绒毛结构破损至坏死、隐窝萎缩;GEVs中Alpha-2贾第素和Alpha-7.3贾第素预处理小鼠后感染贾第虫,能够不同程度显著缓解小鼠体重减少、减少十二指肠滋养体数量、缓解肠绒毛破损和隐窝萎缩,且Alpha-7.3 giardin对小鼠的保护力较Alpha-2 giardin更显著。结果表明:GEVs中多种蛋白可以参与EV生成和贾第虫感染,激活细胞死亡、MAPK、PI3K/AKT、NOD-like受体等信号通路,GEVs中Alpha-2贾第素和Alpha-7.3贾第素能够在体内外激活宿主NLRP3炎性小体,NLRP3炎性小体识别Alpha-2贾第素和Alpha-7.3贾第素抗贾第虫感染。综上所述,本研究阐明了贾第虫可以通过分泌GEVs刺激宿主NLRP3炎性小体激活并调控炎性应答的分子识别机制。NLRP3炎性小体识别GEVs中Alpha-2贾第素和Alpha-7.3贾第素抗贾第虫感染,为治疗和预防贾第虫病提供潜在新靶标。