目的:胰腺癌是消化道中恶性程度较高的肿瘤之一,常见的病理类型是起源于胰腺导管上皮细胞的胰腺导管腺癌。根据美国癌症协会2020年数据显示,胰腺癌为男性新增癌症患者的第十位病因,在女性新增癌症患者中为第九位病因。胰腺癌仍是癌症相关死亡原因的第四位,患者的5年生存率约为9%。在中国,胰腺癌患者的5年生存率也是所有癌症类型中最低的,约为7.2%。既往流行病学研究显示,吸烟、超重、缺乏运动、不良饮食习惯、糖尿病、慢性胰腺炎、幽门螺旋杆菌感染和遗传或后天基因突变等因素与胰腺癌的发生与发展存在重要相关性。由于胰腺癌具有起病隐匿、无明显早期临床症状和易早期转移等特点,导致患者在初次就诊时往往已经处于肿瘤的中晚期,失去了进行根治性手术治疗的机会。因此,提高胰腺癌早期诊断率是提高胰腺癌患者生存与预后的关键之一。在胰腺癌治疗方面,目前手术切除被认为是可能治愈的唯一方法。胰腺癌患者对普通的化疗和放疗均不敏感。最新的免疫治疗可能会提高胰腺癌的治疗效果,但是仍然需要进一步的研究。综上所述,胰腺癌由于其独特的生物学特点和组织解剖位置,导致其存在早期诊断困难、治疗效果不佳和预后生存率较差等特点。为进一步提高胰腺癌诊断和治疗效率,我们需要进一步研究胰腺癌发生与发展相关的分子机制,寻找更为精确的生物标志物和靶点。MicroRNA是一类长度约为18-22个核苷酸大小的非编码RNA,作为一种重要的表观遗传调控因子,可以在转录后水平上调控相应基因的表达。既往研究显示microRNA通过调控特定基因表达的变化参与肿瘤细胞的多种恶性生物学行为,例如肿瘤细胞发生、细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭、细胞周期和细胞凋亡等行为。既往研究显示miR-1224-5p在肺癌、神经胶质瘤和肠型胃癌组织中表达下调。miR-1224-5p可以作为神经胶质瘤和肠型胃癌患者的预后标志物,上述患者中miR-1224-5p表达量较高的患者预后较好。在分子机制研究方面,研究者通过利用细胞和动物实验证实miR-1224-5p可以通过直接靶向作用于FAK基因从而抑制肠型胃癌的转移。在神经胶质瘤中,miR-1224-5p通过靶向抑制CREB1基因的表达进而发挥其抑制胶质瘤进展的功能。在急性肝功能衰竭疾病的氧化应激刺激下,肝细胞中miR-1224-5p的表达量显著提高。miR-1224-5p通过靶向抑制抗凋亡基因Nfib的表达,进而抑制肝细胞的增殖并促进其凋亡。既往研究对5对瘢痕疙瘩和正常皮肤组织进行miRNA芯片测序,筛选两组差异表达的microRNA,发现miR-1224-5p在瘢痕疙瘩组织中低表达。细胞实验证实过表达miR-1224-5p可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭并且促进其凋亡。既往研究显示miR-1224-5p在多种良恶性疾病中均发挥多种作用,但是关于miR-1224-5p在胰腺的相关疾病中是否存在生物学作用还未见相关报道,所以本研究拟进一步研究miR-1224-5p在胰腺癌中发挥的生物学作用。研究方法:1、首先,从公共数据库GEO下载3个胰腺癌相关的miRNA测序数据集,分别为GSE119794、GSE32678和GSE24279,分析miR-1224-5p在胰腺癌组织和正常组织间差异表达情况。采用qRT-PCR方法检测20对胰腺癌组织和其对应的癌旁正常组织miR-1224-5p的表达量。利用qRT-PCR方法检测4种胰腺癌细胞系（As PC-1、Capan-2、PANC-1和SW1990）和人正常胰腺导管细胞h TERT-HPNE中miR-1224-5p的表达量。利用公共数据库TCGA提供的数据分析胰腺癌患者miR-1224-5p的表达量与临床病理信息和预后的相关性。此外,利用细胞转染技术实现在As PC-1和PANC-1胰腺癌细胞中过表达或抑制miR-1224-5p表达,随后利用CCK8、单克隆形成实验、细胞划痕实验和transwell实验检测过表达或抑制miR-1224-5p表达后,胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化情况。2、前面的研究结果显示miR-1224-5p参与调控胰腺癌的恶性生物学行为,为进一步研究miR-1224-5p的具体作用机制,通过利用microRNA靶基因预测网站来预测miR-1224-5p的靶基因,例如Target Scan、miRanda和miRWalk网站。对上述网站的预测结果综合分析提示ELF3可能是miR-1224-5p直接作用的靶基因。随后利用双荧光素酶报告基因实验检测miR-1224-5p与ELF3位点结合情况,同时在胰腺癌细胞As PC-1和PANC-1中敲减或过表达miR-1224-5p后,观察靶基因ELF3在m RNA和蛋白水平的变化。为了明确ELF3基因在胰腺癌中的生物学作用,首先利用GEPIA数据库分析ELF3基因在胰腺癌组织和正常组织间差异表达的情况。随后,利用western blot和免疫组化检测临床上收集的胰腺癌组织和癌旁正常组织中ELF3基因的表达情况,利用western blot检测ELF3基因在4种胰腺癌细胞系（As PC-1、Capan-2、PANC-1和SW1990）和人正常胰腺导管细胞h TERT-HPNE中的表达情况。利用TCGA数据库分析ELF3基因与胰腺癌患者的临床病理信息及预后的相关性。此外,利用慢病毒转染技术构建稳定敲减ELF3基因的胰腺癌细胞系As PC-1和PANC-1,随后利用CCK8、单克隆形成实验、细胞划痕实验和transwell实验检测敲减ELF3基因后,胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化情况。通过设计功能回复实验证实miR-1224-5p通过靶向抑制ELF3基因进而调节胰腺癌细胞的恶性生物学行为,功能回复实验包含两组,其中一组为同时过表达miR-1224-5p和ELF3基因与单独过表达miR-1224-5p进行对比,另一组为同时敲减miR-1224-5p和ELF3基因与单独敲减miR-1224-5p相对比。此外,利用裸鼠皮下荷瘤模型进一步验证miR-1224-5p和ELF3指标在在体情况下对胰腺癌进展的影响。3、为了进一步明确miR-1224-5p/ELF3轴调控胰腺癌的具体分子机制,利用TCGA数据库来源的胰腺癌患者的转录组测序数据进行GSEA富集分析,鉴定ELF3基因相关的信号通路。还利用STRING数据库构建ELF3基因相关的蛋白质相互作用网络图,并且筛选与ELF3基因相关性最高的20个核心基因用于后续GO/KEGG富集分析,进而鉴定ELF3基因相关的分子信号通路。基于TIMER数据库进行ELF3基因表达量与六种免疫细胞浸润程度间的相关性分析。最后,利用western blot实验检测在敲减ELF3基因后,胰腺癌细胞As PC-1和PANC-1中EMT/PI3K/AKT/Notch信号通路中关键分子的变化情况。结果:1、通过分析公共数据库GEO来源的三个数据集（GSE119794、GSE32678和GSE24279）发现miR-1224-5p在胰腺癌组织中的表达量较正常组织显著下调。PCR方法检测胰腺癌组织和细胞,发现miR-1224-5p的表达量在胰腺癌组织和细胞中均下调。基于公共数据库TCGA的相关数据,分析显示miR-1224-5p的表达量在进展期和淋巴结转移的患者中显著下调。通过预后分析发现,miR-1224-5p表达量低的胰腺癌患者预后较差。通过细胞实验证实过表达miR-1224-5p可以显著抑制胰腺癌细胞As PC-1和PANC-1的增殖、迁移和侵袭能力。2、通过microRNA靶基因预测软件和双荧光素酶实验证实,miR-1224-5p可以直接靶向抑制ELF3基因的表达。利用GEPIA数据库初步分析显示ELF3基因在胰腺癌组织中的m RNA表达水平较正常组织显著提高。通过western blot和免疫组化实验检测临床上收集的胰腺癌组织和癌旁正常组织,发现胰腺癌组织中ELF3基因在蛋白水平上也较正常组织显著上调。4种胰腺癌细胞系（As PC-1、Capan-2、PANC-1和SW1990）的ELF3基因表达量均高于人正常胰腺导管细胞h TERT-HPNE。随后利用公共数据库TCGA来源的数据进行分析,提示ELF3基因的表达量在进展期的患者中显著上调,预后分析发现ELF3表达量与胰腺癌患者的预后存在显著相关性,ELF3表达量高的胰腺癌患者预后较差。稳定敲减胰腺癌细胞系As PC-1和PANC-1中ELF3基因的表达,可以显著抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力。通过设计和实施功能回复实验证实miR-1224-5p通过靶向抑制ELF3基因进而调节胰腺癌细胞的恶性生物学行为。利用裸鼠皮下荷瘤模型证实,在在体情况下过表达miR-1224-5p或敲减ELF3基因均可以显著抑制胰腺癌的进展。通过设计同时过表达miR-1224-5p和ELF3基因与单独过表达miR-1224-5p相对比的实验,进一步在在体情况下证实miR-1224-5p可以通过靶向抑制ELF3基因进而抑制胰腺癌的进展。3、随后利用GSEA基因富集分析鉴定ELF3基因相关的信号通路,利用STRING数据库构建ELF3基因相关的蛋白质相互作用网络图并进行GO/KEGG分析,鉴定ELF3基因相关的信号通路。细胞实验结果显示在胰腺癌As PC-1和PANC-1细胞中稳定敲减ELF3基因后,E-cadherin表达水平显著升高,N-cadherin、Vimentin、MMP-9、Snail和Slug表达量显著下调。敲减ELF3基因后P-PI3K和P-Akt表达被显著抑制。此外,敲减ELF3基因后,Notch信号通路的关键蛋白Notch-1、C-myc、Cyclin D1、Hes-1和VEGF表达被显著抑制。上述结果提示ELF3基因通过调节EMT/PI3K/AKT/Notch信号通路进而调控胰腺癌的进展。结论:1、胰腺癌组织中miR-1224-5p的表达量较正常组织显著下调,miR-1224-5p的表达量在进展期和淋巴结转移的患者中显著下调。miR-1224-5p的表达量与胰腺癌患者的预后存在显著相关性,miR-1224-5p表达量低的胰腺癌患者预后较差。细胞功能试验证实过表达miR-1224-5p可以显著抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。反之,抑制miR-1224-5p可以显著提高胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。2、利用双荧光素酶报告和细胞转染实验证实,在胰腺癌细胞中miR-1224-5p可以靶向抑制ELF3基因的表达。ELF3基因在胰腺癌组织和细胞中高表达,且与胰腺癌患者的临床病理信息及预后存在显著相关性。稳定敲减ELF3基因可以显著抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。功能回复实验和在体动物实验证实miR-1224-5p通过靶向抑制ELF3基因表达进而发挥其抑制胰腺癌进展的功能。3、miR-1224-5p/ELF3轴通过调节PI3K/AKT/Notch信号通路进而调控胰腺癌的恶性生物学行为。miR-1224-5p/ELF3轴通过调节EMT过程进而调控胰腺癌的恶性生物学行为。ELF3基因表达量与免疫细胞的浸润程度呈负相关,提示ELF3基因异常表达与胰腺癌免疫微环境异常存在相关性。