研究背景和目的Bietti结晶样角膜视网膜变性（Bietti Crystalline Corneoretinal Dystrophy,简称BCD）是一种严重的遗传性视网膜变性疾病,通常20-30岁发病,50-60岁致盲。遗传方式以常染色体隐性遗传为主,致病基因为位于染色体4q35⁴qter的CYP4V2。该基因编码产物为525个氨基酸的蛋白质,属于CYP450家族,基因全长19kp,包含11个外显子。DNA测序分析世界范围内218个患者在CYP4V2上有62种改变（截至2015年1月）。研究发现中国人群中BCD发病率高,据预测为1/24000。到目前为止,临床报道集中于少数病例基因突变筛查和不完整的临床特征描述。而对BCD人口学特征、遗传特征、临床特征缺乏大宗病例研究。鉴于以上存在的BCD研究中的不足,本研究依托本单位在视网膜变性疾病中的学术优势和本研究单位所处的地域优势,拟以西南地区大样本BCD家系先证者基因检测为契机对BCD人口学、遗传学及临床特征进行分析,以掌握中国人群BCD人口分布、患病率、致病基因热点分布、临床特征、基因型和表型相关性,为深入研究BCD发病机制和个性化治疗奠定基础。方法1.215例BCD患者行规范的人口学和遗传信息登记并进行详细分析,内容包括患者的基本资料、职业、发病年龄、受教育程度、生活能力、营养状况、家庭抚养环境、出生地及祖籍、非遗传性视网膜变性疾病家族史、近亲结婚史及全身其他疾病情况等。收集和分析家系患病情况、婚育状况、双胞胎患病情况,根据BCD患者的病例数和病源,分别统计本院就诊患者中、视网膜色素变性（retinitis pigmentosa,简称RP）患者中BCD患病率、家系分布及地域分布特点。2.115例BCD先证者进行了致病基因筛查,其中92例行CYP4V2扩增直接测序,即设计并合成10对引物,通过聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）扩增CYP4V2的11个外显子并对其产物进行直接测序,其余23例先证者行致病基因二代测序,发现致病突变进行Sanger验证。在家系患者和表型正常的家庭成员中以及100名正常对照组中进行新突变验证。突变类型为splice mutation进行m RNA定量分析和测序,部分突变类型为错义突变时采用insilico分析蛋白质结构、功能域、表面电荷分布改变的预测。采用目标序列捕获芯片,运用目标序列捕获芯片和高通量的ngs技术对1个5代以上bcd大家系的致病基因进行筛查。3.对146例bcd患者292眼完成眼科检查包括最佳矫正视力（bestcorrectedvisualacuity,bcva）、视野（visionfield,vf）、闪光视网膜电图（flashelectroretinogram,ferg）、多焦视网膜电图（multifocalelectroretinogram,mfferg）、眼底彩照、眼底自发荧光（autofluorescence,af）和黄斑区光学相干断层扫描（opticalcoherencetomograpy,oct）,对af、ferg和mferg进行分型,对oct进行分期,分析不同af分型的临床特征,结合基因检测结果分析115例bcd家系先证者和家系患病成员表型和基因型相关性,分析1个bcd大家系患者致病基因及临床特征。结果1.184个家系215名患者,男女比例为110:105,均为汉族;常染色体隐性遗传是184个家系患者唯一遗传方式,近亲结婚患病比例为3.2%;一对同卵双胎女性bcd患者,占家系患者0.6%。家系中bcd表型和正常表型的比例为1:3.8;患者、养子女、养父母的患病比率1:0:0;家系中一级亲属患全身疾病比率约25.1%。bcd在rp中的比例为18.5%,在本院就诊患者中的患病率为4.6/10万;bcd患者初始症状平均年龄31.7±16.8岁,就诊年龄平均41.8±23.1岁,就诊年龄和发病年龄差异有显著统计学意义（p=0.01）。各年龄段患者发病率差异有显著统计学意义（p=0.03）。215例bcd患者中95%出生地在中国西南地区,其中祖籍来自湖南、湖北、广东三省患者占30.7%。80%患者生活居住源于农村,20.1%女性患者疾病加重与妊娠,分娩,哺乳,绝经有关,10%患者认可不良生活和工作环境加剧病情进展。2.115例bcd先证者分离出cyp4v2突变共22个,其中9个是新的;最常见的突变是c.802₈10del17insgc,其等位基因频率为48.7%（112/230）。100例正常对照未发现新的错义突变。dbsnp预测均为有害。insilico分析y343d突变体改变了cyp4v2蛋白质二级结构和蛋白表面电荷分布。3.146例bcd患者视网膜和玻璃体内观察到结晶颗粒,红外眼底照相中结晶颗粒显示最清楚,结晶沉积局部视网膜色素上皮受损的程度与af分型、oct、mferg结果显示视网膜局部形态和功能受损一致,早期患者无视力下降和夜盲症状。i期bcd患者af多为椒盐型低af,61.8%2-3期bcd患者呈地图样低af、弥漫低af、血管型高af分别占30.2%、55.6%、13.1%。oct分期显示黄斑区中心凹下视网膜外层交叉区、肌样体区、椭圆体区,外界膜依次缺失、rpe/bruch膜薄变和脉络膜厚度渐变薄的过程。af分型、va、mferg-p1波1环振幅密度、1-4环振幅密度总和、1-6环振幅密度总和、csft、患者年龄以及眼底分期之间两两相比p<0.01。然而5种ferg分型显示视网膜感光细胞受损多样性,早期ferg正常的bcd患者,mferg异常,首发症状为夜盲的患者ferg为cone-dominantferg,而首发症状为视力下降的bcd患者ferg为rod-dominant型。bcd患者平均每年视力下降比率为6.44%,3年内bcd患者眼底改变缓慢,而af的变化明显。bcd患者af分型与va、mferg-p1波振幅密度、csft、患者年龄以及眼底分期直接相关,p<0.01。af分型、oct分期和mferg分型是高度相关的。1型椒盐状af的bcd患者其oct分期显示为1²期改变,mferg表现正常型或降低型;2型地图样af患者的oct改变显示2⁴期改变,50%患者mferg为降低型,50%为熄灭型;3型弥漫型af患者相应的oct分型为3⁵期改变,80%患者mferg熄灭型;4型血管型af患者oct5期,mferg均呈熄灭型。早期ferg正常的bcd患者,mferg异常,首发症状为夜盲的患者ferg为cone-dominantferg,而首发症状为视力下降的bcd患者ferg为rod-dominant型。4.纯合突变c.802-8₈10del17insgc、c.1091-2a>g和复合杂合突变c.802-8₈10del17insgc+c.992a>c、c.802-8₈10del17insgc+c.1091-2a>g四种突变类型组合占115例bcd先证者cyp4v2筛查全部等位基因比例分别为28.1%、5.3%、14.0%、6.1%,各组发病年龄和病程比较,p>0.05。不同患者拥有纯合突变c.802-8₈10del17insgc的ferg和mferg比较,p>0.05。而同一家系内bcd患者发病年龄、眼底分期均不同。5.1个bcd大家系12名患者致病基因是prpf3,表型呈典型rp,临床特征夜盲出现早,30岁左右呈法律盲,其遗传模式呈常染色体显性遗传。先证者致病基因筛查为cyp4v2,临床表型为bcd,临床特点:夜盲出现晚,病情进展缓慢,父母及儿子为隐性携带者,遗传模式为常染色体隐性遗传。结论1.通过中国人群bcd人口学特征、遗传特征、患病率分布的遗传流行病学研究,揭示了bcd患者地域分布与常染色体隐性遗传方式之间的关联,关注到环境因素对bcd发生发展的干扰因素。2.本研究样本的最常见致病突变热点是cyp4v2外显子7的缺失插入突变（c.802-8₈10del17insgc）,识别并得到验证的9个新突变扩大了cyp4v2突变谱,中国人和欧美籍患者的突变谱不同,存在种族差异。3.BCD患者AF分型较传统眼底分期更合理反映了BCD后极部视网膜外层形态变化和功能异常特征以及BCD进程,可以作为BCD临床相关研究的评价标准。4.CYP4V2基因型与BCD发病年龄、病程或ERG变化无关联,即使在同一家系患者中,即BCD患者基因型和临床表型高度变异,提示除基因突变因素外环境因素在BCD发生发展中的作用。5.BCD复杂大家系中2种以上共存独立基因发现、表型和遗传模式差异为遗传学研究和遗传咨询提供了新的思路和方法。