c-ret原癌基因(rearranged during transfection)的表达产物Ret是受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)家族的一员，在神经内分泌系统和肾的发育中以及精子发生、甲状腺功能调节中具有重要作用。但失控的Ret与某些恶性的神经内分泌肿瘤的发生发展密切相关，如多发性内分泌腺瘤病2型(multiple endocrine adenomatosis type 2，MEN2)等。甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma，MTC)是MEN2患者普遍的临床症状(发生频率>95％)，预后极差，对放疗和化疗不敏感，是MEN2主要的夕匕亡原因。因此探讨其它有效的治疗手段成为必然，如免疫治疗。在治疗ret相关肿瘤方面Ret是潜在的肿瘤相关抗原靶点，但目前还没有相关的研究报道，可能是目前还未有理想的动物模型。 MT／ret 304／B小鼠是一种携有人类c-ret原癌基因的转基因小鼠，其ret基因受金属硫蛋白(MT)-I启动子控制，小鼠出生后从乳汁中接触到重金属元素，开始启动Ret表达，持续高活性的Ret促进了细胞的恶性变，小鼠在4周龄左右开始自发性地生长肿瘤，肿瘤的特点是头颈部显著，多发，与腺体关系密切，因此认为该系小鼠是目前人类ret相关肿瘤研究的极佳的动物模型。 肿瘤免疫耐受是肿瘤免疫治疗的瓶颈，是目前临床恶性肿瘤防治中需要解决的首要问题。现在发现肿瘤免疫耐受涉及众多机制，其中吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)介导的肿瘤免疫耐受被认为是普遍的肿瘤免疫逃避机制。IDO广泛表达于哺乳动物体内的肝外组织，是催化机体必需氨基酸——色氨酸代谢为犬尿氨酸的关键限速酶，其分布和功能与神经、内分泌和免疫调节极为相关。研究表明，肿瘤多表达自身抗原，免疫系统可能利用IDO机制来建成耐受的微环境从而抵御免疫攻击，防止自身免疫性反应。在肿瘤免疫逃避的建成中，IDO会使局部色氨酸耗竭并造成犬尿氨酸的积累，从而使对色氨酸耗竭敏感的效应T细胞发牛凋亡以及肿瘤抗原特异性T细胞的克隆增殖反应受到抑制，进而导致T细胞无能(anergy)，最终诱发肿瘤免疫耐受。在肿瘤和肿瘤引流淋巴结(Tumor draning lymph nodes，TDLNs)，表达IDO的抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APCs)如树突状细胞(dentrite cells，DCs)对于肿瘤免疫逃避的建成关系极为密切。现在发现针对IDO相关的肿瘤免疫耐受机制使用IDO抑制剂可以有效地解除肿瘤免疫耐受，如1-甲基色氨酸(1-methyl tryptophan，1MT)作为佐药已进入临床研究并取得显著效果。但考虑到IDO在机体神经、内分泌和免疫调节中的重要作用，全身大量给予1MT将会破坏机体的内稳态，因此研究1MT给药途径，作用方式，作用范围，必将对临床肿瘤治疗中在维持机体内稳态的基础上解除肿瘤免疫耐受提供重要依据。综上所述，本研究的主要目的是：+通过MT／ret 304／B小鼠模型，以Ret为靶抗原探索ret相关肿瘤的免疫治疗的可行性及策略；通过MT／ret 304／B小鼠模型解析自发性肿瘤的免疫逃避机制；优化1MT的给药方法，探索ret相关肿瘤治疗中1MT如何给药可以达到不破坏机体的内稳态并解除IDO所致肿瘤免疫耐受。 本研究的主要内容是： 1、探讨Ret的免疫原性，优化Ret作为疫苗的条件，为其作为肿瘤相关抗原靶点的可行性提供必要的实验依据。 2、针对肿瘤的IDO介导的免疫耐受机制，探索解除原发性肿瘤免疫耐受的条件，以此为契机，探讨在解除IDO介导的免疫耐受的情况下，ret相关肿瘤的免疫治疗策略。其中包括： (1)全身性给药抑制IDO的活性，是否可以解除天然免疫耐受? (2)考虑到IDO在机体内稳态中的重要调节作用，改变1MT的给药途径，将1MT修饰Ret抗原而合成Ret-1MT免疫MT／ret 304小鼠，探讨这种摹于APCs靶向的IDO抑制足否仍然可以解除火然免疫耐受? 本研究主要结果包括： 1、Ret抗原具有强免疫原性：经C57BL／6小鼠实验证实，Ret抗原不但可诱导较强的体液免疫应答，而且也可以诱导较高强度的细胞免疫应答水平；CpG ODN佐剂与Ret抗原可以加强Ret抗原的免疫原性； 2、在MT／ret 304转基因小鼠中，Ret／CpG疫苗不能有效地诱导细胞免疫应答，小鼠的肿瘤生长并无明显延缓，在免疫期内每天腹腔注射IFNγ也并不能改善Ret／CpG疫苗的细胞免疫应答水平；通过免疫组化研究证实，伴随白发肿瘤牛长，小鼠的脾脏和TDLNs中IDO呈现高表达，特别是在Ret／CpG疫苗免疫后，IDO表达更为显著。表明IDO可能足阻碍Ret／CpG疫苗免疫诱导细胞免疫应答的重要原因。 3、在1MT全身给药后，Ret／CpG疫苗可以有效改善MT／ret 304小鼠的细胞免疫应答水平，IFNγ处理可以增强此效应，同时IHC研究证实在肿瘤组织有CD8+T细胞浸润，并且肿瘤生长明显延缓。以上结果显示Ret／CpG+1MT的免疫方案可以有效提高小鼠的细胞免疫应答，进而解除肿瘤免疫耐受，抑制MT／ret 304小鼠的自发性的肿瘤牛长： 4、针对1MT全身性给药可能影响整体生理机能，故根据免疫原理制备DCs靶向的抗原Ret-1MT，研究表明Ret-1MT的免疫原性并无明显改变；体外研究证实Ret-1MT具有伴随细胞内吞过程解离并在细胞内抑制IDO活性的能力； 5、Ret-1MT／CpG免疫可以有效地解除MT／ret 304小鼠的免疫耐受，促进肿瘤特异性的免疫应答，加强CD8+细胞对肿瘤的浸润，抑制自发性的肿瘤生长。 本研究的主要结论和意义是： 1、采用了自发性肿瘤小鼠模型，其实验结果模拟人类原发性肿瘤具有重要价值； 2、Ret抗原具有较强的免疫原性，是相关疾病的潜在的免疫治疗靶点；Ret疫苗具有成为临床ret相关恶性肿瘤的治疗手段的潜能； 3、自发性肿瘤免疫耐受中IDO是一个重要的机制，IDO诱导的耐受主要与Th1和CD8+T细胞应答有关； 4、Ret／CpG+1MT+IFNγ的组合和Ret-1MT／CpG+IFNγ的组合免疫均可有效地解除免疫耐受，而后者因其具有针对APCs尤其足DCs细胞内的IDO活性的专一性，可以避免前者整体上抑制IDO活性可能对机体白稳机制的破坏，从而有希望成为临床ret相关恶性肿瘤的防治手段；APCs靶向性地抑制IDO活性的策略也可以为临床其它恶性肿瘤的防治提供借鉴。