论文部分内容阅读
阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease,AD）是一种以认知功能障碍和记忆力丧失为主要临床特征的神经退行性疾病,会对脑细胞及中枢神经系统造成不可逆转的伤害。在AD患者出现明显的临床症状之前,实现AD的早期诊断并及时地进行治疗干预是减少伤害的有效方法。已有研究表明环境污染物在AD的发病机制中起着重要作用,其中对镉(Cd2+)的神经毒性研究较多,表明Cd2+暴露会引发类似于AD的病理学变化,然而Cd2+暴露与AD发病之间的相关性尚待阐明。因此,建立用于AD早期诊断的方法对于评估Cd2+暴露与AD发病之间的相关性具有重要的现实意义。由β-淀粉样蛋白（Aβ）聚集形成的细胞外淀粉样蛋白斑和磷酸化的tau蛋白组成的细胞内神经纤维缠结是AD的两个主要病理特征,并且脑内乙酰胆碱酯酶（AChE）的水平也与AD的认知功能障碍密切相关。因此,将AChE与Aβ、tau蛋白两种特征生物标志物结合,在AD的发病进程中监控这些指标的变化,可以为AD的早期诊断提供方法和依据。本论文针对AD的特征/相关生物标志物（Aβ、Tau蛋白、AChE）,设计了一系列灵敏度高、选择性好的高效可靠的新型光分析方法,实现了正常大鼠和Cd2+暴露大鼠脑脊液（CSF）中上述生物标志物的分析检测,不仅为AD的早期诊断提供了依据,也为探讨Cd2+暴露与AD发病之间的相关性提供了方法。具体研究内容如下:（1）基于CDs@Eu/GMP无限配位聚合物（CDs@Eu/GMP ICPs）建立了一种高灵敏度和高选择性的比例型荧光法检测AD的生物标志物Aβ单体。由壳聚糖合成的碳点（CDs）表面含有丰富的官能团（-NH2和-COOH）,可以作为有效的天线配体敏化Eu3+,并与鸟苷磷酸二钠（GMP）自组装形成发红色荧光的CDs@Eu/GMP ICPs。形成的CDs@Eu/GMP ICPs表现出CDs和Eu3+的特征发射峰。利用Cu2+与CDs和Aβ单体之间的竞争配位作用,Eu3+的红色荧光关闭或打开,而CDs的荧光强度保持不变,基于此建立了一种内参比式的比例型荧光法检测Aβ单体。该方法的灵敏度高,检测限为0.17 n M,且不受鼠脑中其它共存物质的干扰。利用设计的比例型荧光法,实现了正常鼠和AD鼠CSF中Aβ单体总量的分析检测。（2）基于凝溶胶蛋白（gelsolin）修饰的银纳米三角（Ag NTs）和银纳米棒（Ag NRs）构建了一种聚集型比色传感器阵列,首次实现了复杂脑样品中Aβ42和Aβ40的同时鉴别和检测。与测定Aβ单体总量相比,同时识别和检测脑中含量最丰富的Aβ40和最易聚集的Aβ42更能反映AD认知进展的程度。由于gelsolin与Aβ40和Aβ42之间特异性结合能力的不同,导致gelsolin修饰的Ag NTs和Ag NRs产生不同程度的聚集,从而表现出不同的光谱和颜色变化,借助主成分分析技术（PCA）对光谱变化进行定量分析,生成独特的指纹图谱,能够同时识别和检测Aβ40和Aβ42(即Aβ42%)。该阵列成功区分了不同浓度（10 n M-500 n M）的两种Aβ变体以及不同比例的Aβ混合物,且不受鼠脑中共存物质的干扰。利用设计的比色传感器阵列,实现了正常大鼠和Cd2+暴露大鼠CSF中Aβ42%的分析检测。（3）结合适配体（aptamer）与具有不同荧光颜色的纳米ZnO构建了一种全新的荧光传感器阵列,首次实现了CSF中tau381,tau410和tau441的模式识别和检测。Tau蛋白病理学继发于Aβ病理学,同时鉴别和检测CSF中结构相似的tau蛋白亚型能够更好地监控AD的发病进程。由于aptamer与tau381,tau410和tau441之间的特异结合能力不同,导致aptamer修饰的蓝色荧光和红色荧光ZnO在紫外区和可见光区产生不同的光谱变化,借助PCA定量分析光谱变化产生独特的指纹图谱,能够同时鉴别和检测tau381,tau410和tau441（即tau441%）。该阵列成功区分了不同浓度(10 pg m L-1-500 pg m L-1)的三种tau蛋白亚型以及不同比例的tau蛋白亚型混合物,且不受鼠脑中其它共存物质的干扰。利用设计的荧光传感器阵列,实现了正常大鼠和Cd2+暴露大鼠CSF中tau441%的分析检测。（4）结合安装有颜色识别APP的智能手机,构建了基于CDs@Eu/GMP ICPs的纸基比色传感器用于分析检测复杂脑样品中的AChE。AChE被认为是与AD发病相关的早期生物标志物,可以与Aβ、tau蛋白两种特征生物标志物结合共同监控AD发病的进程并对无症状阶段的AD脑风险患者进行随访诊断。首先将表面含有丰富官能团且发蓝色荧光的CDs作为客体分子包裹进Eu/GMP ICPs的网络结构中得到发红色荧光的CDs@Eu/GMP ICPs。AChE及其底物硫代乙酰胆碱（ATCh）衍生出的硫代胆碱（TCh）会破坏CDs@Eu/GMP ICPs的配位环境,导致CDs@Eu/GMP ICPs的网络结构崩塌以及客体分子CDs释放到周围环境中,从而使得Eu3+的红色荧光下降和CDs的蓝色荧光增强。CDs@Eu/GMP ICPs在试纸上呈现出的“红至蓝”荧光颜色变化与安装有颜色识别APP的智能手机相结合可实现对AChE的定量检测。纸基比色传感器的最低检测浓度约为2mU mL-1,且不受鼠脑中其它物质的干扰。利用纸基比色传感器与智能手机集成的新型分析平台,实现了正常大鼠和Cd2+暴露大鼠CSF中AChE的分析检测。上述设计的一系列新型光分析方法成功实现了正常大鼠和Cd2+暴露大鼠CSF中AD特征/相关生物标志物的分析检测,不仅为AD的早期诊断提供了方法和依据,也为探究Cd2+暴露与AD发病的相关性提供了新的分析平台和思路。