【摘 要】
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体细胞胚发生具有普遍、遗传稳定、适于作为外源基因转化受体系统等优点,对百合产业中的遗传性状改良和种球优质繁育具有重要意义。本课题组前期明确了miR171在百合体胚发生过程中具有重要作用,然而其调控百合体胚发生的作用机制及内部调控网络尚未明确。本文以miR171为研究切入点,利用过表达、点突变、STTM人工沉默和CRISPR/Cas9基因编辑技术明确了lpu-e TM171a/b、lpu-miR17
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体细胞胚发生具有普遍、遗传稳定、适于作为外源基因转化受体系统等优点,对百合产业中的遗传性状改良和种球优质繁育具有重要意义。本课题组前期明确了miR171在百合体胚发生过程中具有重要作用,然而其调控百合体胚发生的作用机制及内部调控网络尚未明确。本文以miR171为研究切入点,利用过表达、点突变、STTM人工沉默和CRISPR/Cas9基因编辑技术明确了lpu-e TM171a/b、lpu-miR171a/b及靶基因Lp SCL6-II/I在细叶百合体胚中的功能,构建了百合体胚发生过程中e TM-miRNA-Target调控网络,揭示了e TM-miR171-SCL6模块之间的调控关系,对明确百合体胚发生机制具有重要意义。主要研究结果如下:1.创建了以细叶百合胚性愈伤组织为受体的稳定高效遗传转化体系,遗传转化效率达到29.17%。将CRISPR/Cas9基因编辑系统成功应用于百合,对标记基因Lp PDS进行了定向敲除,对突变体进行测序发现存在碱基插入、替换和缺失。上述遗传转化体系和基因编辑技术在百合中成功应用,为百合遗传性状改良和功能基因研究奠定了基础。2.在百合植株体内,lpu-miR171能切割靶基因Lp SCL6并抑制其表达。lpu-miR171a/b过表达百合植株根系发育受阻、叶片数量减少;沉默植株根系粗壮,叶片数量较多。沉默lpu-miR171a/b促进了百合体细胞胚的形成和发育,并显著缩短体胚发育进程,沉默株系的淀粉含量明显高于野生型,且细胞周期关键基因Lp CYCB1和Lp CYCD3显著上调,其中miR171b的作用更加显著。3.为进一步明确lpu-miR171的功能,研究了其靶基因Lp SCL6在百合体胚发生中的功能。结果表明:Lp SCL6-I和Lp SCL6-II蛋白均属于核蛋白。在百合中Lp SCL6-II/I可以正反馈调节lpu-miR171a/b。Lp SCL6-II/I超表达株系体胚发生提前、发育周期较短,且子叶形胚形成率较高,伴随着细胞周期关键基因Lp CYCB1和Lp CYCD3的显著上调。因此,超量表达Lp SCL6-II/I可正向调控百合体细胞胚发生。同时,Lp SCL6-II/I超表达株系的体胚中淀粉合成酶基因Lp AGP1、Lp SSS1和Lp GBSS均显著上调,而淀粉代谢酶关键基因Lp AMY和Lp BAM均显著下调。4.为解析lpu-miR171在百合体胚发生过程中的调控网络,对百合体胚发生过程中e TM对lpu-miR171的调控作用进行了研究。从细叶百合中克隆得到lpu-e TM171a/b的c DNA全长,其中lpu-e TM171a长度为1383 bp,编码460个氨基酸,与海枣（Phoenix dactylifera）同源性较高,达79.29%;lpu-e TM171b长度为1869 bp,编码622个氨基酸,与油棕（Elaeis guineensis）亲缘关系最近且同源性较高,达68.24%。lpu-e TM171a/b蛋白均属于核蛋白。构建lpu-e TM171a/b和点突变过表达载体并转化百合,lpu-e TM171b过表达系的体胚发生后期观察到有少量体胚萌发形成子叶形胚。高表达lpu-e TM171a/b对相应靶标的lpu-miR171a/b存在负调控作用,对应靶基因Lp SCL6-II/I的表达水平显著增加;而点突变过表达系Me TM171a/b中miR171a/b和靶基因Lp SCL6-II/I的表达量与对照相比无显著变化。上述结果表明lpu-e TM171是miR171的诱饵分子,具有绑定lpu-miR171从而阻止对靶基因Lp SCL6的切割作用。综上,沉默lpu-miR171a/b或者超量表达靶基因Lp SCL6-II/I出现体胚发生提前、体胚发育周期较短,且子叶形胚形成率较高,并伴随着淀粉含量升高,加快子叶型胚的形成。高表达lpu-e TM171a/b通过影响lpu-miR171a/b的活性进而影响Lp SCL6-II/I的表达。本研究明确了e TM-miR171-SCL6模块参与调控细叶百合体胚发生的作用模式。
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