天山郁金香种子休眠解除机制研究

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wish_hjl
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天山郁金香(Tulipa thianschanica Regel)为百合科(Liliaceae)郁金香属(Tulipa)多年生野生花卉,分布于中国新疆西部和中亚地区,花色艳丽、花型独特、抗性强。经过漫长的进化适应,郁金香种子形成了特有的休眠机制。然而,休眠特性是导致郁金香种子萌发率低和萌发不整齐的根本原因,限制了郁金香的育种进程。本研究利用生理生化测定方法和超高效液相色谱法(UPLC-MS/MS),对天山郁金香种子的休眠特性进行分析;并系统研究了温度、激素、层积等因子对打破休眠和萌发的影响,建立了天山郁金香种子休眠解除的方法;利用Illumina/Solexa Hiseq 2500测序技术,对冷层积不同天数的天山郁金香种子进行测序,获得相应的转录组信息和mi RNA数据,从分子水平探讨天山郁金香种子休眠解除的机理,这有助于人工调控郁金香种子的萌发、缩短种子休眠时间,同时对郁金香育种具有重要的理论和实践意义。主要结果如下:1.对天山郁金香种子生物学特征和休眠特性进行了深入研究。结果表明,天山郁金香种子不存在吸水障碍,即种子休眠的原因不是由种皮的机械性束缚导致的。天山郁金香种子粗提液显著抑制白菜种子胚根的生长,证实内源萌发抑制物质的存在;随着提取液浓度被稀释,抑制作用逐渐减弱。不同极性有机溶剂梯度提取抑制效应表现为甲醇相>乙酸乙酯相>丙酮相>正己烷相>水相。不同层积下,天山郁金香种子内源代谢物质含量变化显著,表现为层积1 d供能物质含量较高,层积20 d后显著下降,层积40 d再度升高。淀粉酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶均随层积时间的变化而变动,层积前期(1-20d),酶活力较弱,而层积后期(30-40 d),酶活力显著升高。UPLC-MS/MS测定发现天山郁金香种子中内源ABA含量随着种子的吸水、后熟和休眠的打破先升高后降低,层积20 d时,ABA含量最高,为38.7μg/kg,GA3的含量变化与ABA的变化趋势相反,细胞分裂素ZR和生长素IAA的含量持续升高。2.通过温度、激素和层积试验,建立了高效的郁金香种子破眠方法。结果表明,4℃处理条件下,天山郁金香种子的萌发率最高,为80.67%,其次为变温4/16℃,种子萌发率为55.60%,而当温度高于16℃,天山郁金香种子不再萌发。外源赤霉素的施加显著提高了天山郁金香种子的萌发率,最优施加浓度为100 mg/L,激动素也能促进种子的萌发,但不显著。相比外源激素的单独施用,不同浓度的激素组合对种子的萌发促进作用更高效,最优浓度的激素组合为GA3 100 mg/L+KT 10 mg/L。3.利用高通量测序技术对生理休眠(PD)、休眠解除(DR)、非休眠(ND)3个发育时期的天山郁金香种子进行RNA-seq分析,共获取大于72 Gb的数据量,样本平均数据为8.13 Gb,注释得到102090条Transcript和40460个无冗余Unigenes。差异基因在碳水化合物代谢、能量代谢和植物激素生物合成与信号转导等代谢途径中注释到的数目较多,3大代谢途径中共筛选120个与休眠解除代谢相关的Unigenes,并以激素合成与代谢相关基因作为参考,对25个差异进行了q RT-RCR的验证。ABA和GA合成与信号转导基因存在显著的拮抗关系;促进休眠解除的植物激素,IAA和ETH合成基因均上调表达。同时对包括5个基因家族,共47个转录因子进行了表达分析,层积后期,b ZIP-like和b HLH-like基因表达显著下调,而DREB-like,MYB-like和WRKY-like基因均显著富集且上调。4.构建3个mi RNA测序文库,共注释到34个mi RNA家族信息,其中包括14个新家族和20个已知家族信息,均可能参与天山郁金香种子休眠解除过程。富集到的差异mi RNA中,Tpmi RNA167和Tpmi RNA395上调表达。Tpmi RNA166靶向抗氧化反应关键酶,且均下调表达。PC-5p-84014和Tpmi RNA159分别靶向Tp PYL和Tp DELLA转录因子,进而影响ABA/GA含量,靶基因Tp CYP707A1上调表达,减弱ABA合成信号,这种负反馈调节机制对种子从休眠态到萌发态的转变至关重要。Tpmi RNA160和Tpmi RNA164参与IAA信号转导过程,并与ABA相互作用,进而参与休眠的解除。Tpmi RNA5072在低温贮藏期间持续下降,其潜在的靶基因可能被激活以参与能量代谢和氧化物质清除的过程,进而促进种子萌发。
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