本文主要从以下两个部分展开论述：　　第一部分:MUTYH基因AluYb8插入变异下调其1型蛋白表达、降低细胞线粒体活性的功能机制研究　　人类的MUTYH基因（human homolog gene of Escherichia coli mutY）编码的A/G特异的腺嘌呤DNA糖基化酶(A/G-specific adenine DNA glycosylase)作为碱基切除修复(base excision repair，BER)途径的重要组成部分，对于修复细胞DNA氧化损伤和维持DNA复制保真性是至关重要的。人类细胞中存在多种MUTYHmRNA转录本，编码两种主要的MUTYH蛋白亚型，即MUTYH1型和MUTYH2型蛋白。1型蛋白(CCDS41320.1)由535个氨基酸组成(～60 kDa)，在其N端含有线粒体定位信号序列（mitochondrial targeting signal，MTS），主要定位于细胞线粒体内。2型蛋白(CCDS41322.1)由521个氨基酸组成(～57 kDa)，由于缺少N端的MTS，其蛋白C端存在的核定位信号序列(nuclear localization signal，NLS)引导其定位于细胞核内。本实验室前期工作在中国人群中发现了MUTYH基因第15内含子存在AluYb8插入多态性变异（Alu Yb8MUTYH）。该变异与其携带者细胞中的DNA氧化损伤累积和衰老相关性疾病风险增高相关联。在人群中依据MUTYH基因第15内含子是否存在AluYb8插入(Presence，P或Absence，A)分为3种基因型:纯和缺失（野生）型(A/A)，纯和插入型（P/P）和杂合型（A/P）。　　文献报道显示，Alu元件的插入能够导致许多人类遗传疾病的发生，并且能够参与宿主基因的表达调控。为阐明AluYb8MUTYH变异导致该基因功能受损的机制。我们利用qrtPCR(quantitative real-time PCR)和蛋白免疫印迹(immunoblotanalysis)方法分析了不同AluYb8MUTYH基因型健康个体的外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs)内MUTYH基因的表达;发现，AluYb8MUTYH变异与PBMCs中降低的1型MUTYH蛋白表达相关。1型MUTYH蛋白定位于线粒体，是线粒体中DNA糖基化酶的主要类型之一，能够启始线粒体内BER途径(mitochondrial BER，mtBER)。通过不同AluYb8MUTYH基因型健康个体PBMCs中细胞核基因组(Nuclear DNA，nDNA)和线粒体基因组(mitochondrial DNA，mtDNA)的长片段定量PCR分析(Long-range quantitativePCR assay)可知:AluYb8MUTYH变异与降低的mtBER能力相关联。为进一步探讨MUTYH基因第15内含子中AluYb8插入对mtDNA氧化损伤的影响，我们募集了54例新生婴儿的脐带血和255例健康成年个体的外周血样本，并检测了外周血DNA样品中的mtDNA含量。结果表明:伴随衰老进程引起的DNA氧化损伤逐步累积，Alu Yb8MUTYH与降低的mtDNA含量相关。利用人类原代成纤维样细胞进一步分析表明，该变异与降低的线粒体含量和减弱的基础氧气消耗率相关。　　结果表明，Alu Yb8MUTYH变异能够导致1型MUTYH蛋白表达降低，通过影响细胞mtDNA拷贝数的稳定，引起线粒体功能的降低。这从一个新的视角上，解释了该变异与衰老相关疾病发病风险增高的相关。　　第二部分:MUTYH基因AluYb8插入变异与mtDNA含量改变及衰老相关性疾病风险机制的研究　　随着人类社会经济的发展、生活水平的提高，2型糖尿病(type2 diabetesmellitus，T2DM)已成为主要的公共健康问题之一，病情的发展严重影响患者的生活质量，甚或生命。T2DM病因复杂，世界各国对其已投入很大的研究力量，但其发生机制还远未彻底阐明。我们实验室前期工作揭示，人类MUTY基因第15内含子存在一个AluYb8插入/缺失多态性，Alu Yb8MUTYH。该变异是2型糖尿病的一个遗传风险因素，并与2型糖尿病患者外周血白细胞DNA中8-OH-dG（8-hydroxy-2-deoxyguanosine）损伤累积相关。在先前研究中，我们已经证明，AluYb8MUTYH通过明显下调线粒体定位的1型MUTYH蛋白表达，改变MUTYH基因的表达模式（1型蛋白和2型蛋白的比值），与健康成年个体中mtDNA含量的降低相关。　　为了更好的理解AluYb8MUTYH与2型糖尿病发病风险的关系。本研究主要探讨了2型糖尿病患者中该变异与mtDNA含量、mtDNA转录（mitochondrialRNA，mtRNA）和线粒体增殖和动力学调控相关基因表达的相关性。我们利用实时定量PCR(real-time PCR)技术，分析了1262型糖尿病患者和126例匹配的健康对照个体外周血细胞中的mtDNA含量。同时，利用实qnPCR方法，检测了18例2型糖尿病患者PBMCs中的6个mtRNAs(MT-RNR2，MT-CO1，MT-CO2，ATPase6，MT-ND1和MT-CYB)和7个增殖和动力学调控相关基因(TP53, NRF-1，PLOG，DRP1，MFN2，OPA1和ATG7)的表达。　　结果显示，2型糖尿病患者外周血细胞中的mtDNA含量显著高于匹配的健康对照组。发现携带P/P基因型的健康对照个体与携带A/A和A/P基因型的健康对照个体相比较，其外周血细胞具有低水平的mtDNA含量;这与之前的研究结果是一致的。携带P/P基因型的2型糖尿病患者外周血细胞中mtDNA含量显著高于携带A/A和A/P基因型的患者。更为有趣的是，相同基因型2型糖尿病患者和健康对照的比较中，仅仅是携带有P/P基因型的2型糖尿病患者比携带同基因型的健康对照具有显著升高的mtDNA含量。然而，携带P/P基因型的患者虽具有升高的mtDNA含量，但细胞mtDNA的表达（mtRNAs）并没有随同mtDNA拷贝数的增加而增加。与此相对应，观察到，相对于携带A/A基因型或A/P基因型患者，携带P/P基因型的患者其外周血细胞中TP53，NRF-1，PLOG，MFN2，OPA1和ATG7等基因的转录表达显著降低。这些基因对于维持线粒体发生，线粒体分裂/融合以及线粒体自噬清除等线粒体网络活性的维持是必不可少的。　　结果表明:2型糖尿病中Alu Yb8MUTYH变异与线粒体含量异常、mtRNA转录以及线粒体发生和分裂/融合等网络调控相关基因表达降低有关。携带P/P基因型患者的外周血单核细胞具有升高的mtDNA含量，这可能是该基因型引起其体细胞线粒体内MUTYH蛋白显著下调，mtDNA氧化损伤修复障碍导致的细胞易于出现氧化应激条件下的代偿效应。其中不具功能的受损mtDNA增多，而功能性mtDNA减少。同样，这些结果也表明，在病理性强氧化应激条件下，MUTYH可能是通过增加BER修复中间体，即mtDNA单链断裂(single strandbreaks，SSBs)，促进过量聚集氧化损伤的mtDNA降解来维持mtDNA完整性。因此本研究的结果在一定程度上能够解释Alu Yb8MUTYH变异对于2型糖尿病发病风险的贡献。