北京油鸡滑膜间充质干细胞的分离培养及鉴定

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目的:畜禽遗传资源一直以来都是我国的宝贵财富,是农业生产的基石、人民生活的保障,是我国畜牧业发展中重要的研究资料,家养动物遗传资源的保存应当受到相当的重视。间充质干细胞因其具有自我更新能力和多向分化潜能,在遗传资源的保护与利用和组织工程学等方面取得了广泛认可,从而为畜禽遗传资源的保护提供了新的可能。本实验以北京油鸡滑膜间充质干细胞为试验对象,成功建立了其体外培养体系,并对其生物学特性和诱导分化能力进行研究。方法:使用17日龄北京油鸡种蛋中鸡胚进行SMSCs的分离,通过组织块贴壁法和胶原酶消化法两种方式分离北京油鸡SMSCs,用DMEM-F12+10%FBS+10 ng/m L b FGF+10 ng/m L LIF+2 m M谷氨酰胺+100 IU/m L青、链霉素混合物的完全培养基传代培养,通过绘制细胞生长曲线、计算克隆团形成能力、核型分析、反转录PCR(RTPCR)、免疫荧光鉴定、流式细胞术阳性率分析和诱导分化试验验证北京油鸡SMSCs的生物学特性。结果:北京油鸡SMSCs在体外成功培养至29代,细胞在培养皿中贴壁生长,形态为长梭形。小代次细胞,边界清晰,核质明显,长势良好,折光率高,立体感强;高代次细胞,胞体变大、胞质疏松、边缘模糊,无明显细胞边界、立体感下降、折光效果变差。取P5、P15、P25三个代次的细胞绘制细胞生长曲线,呈现出典型的“S”形生长,通过公式计算可知,P5、P15、P25三个代次细胞的群体倍增时间(PDT)依次为25.30h、26.31h和29.17h,表明细胞的增殖能力会随着细胞代次的升高而降低。通过P5、P15、P25三个代次细胞克隆团形成能力实验结果表明,北京油鸡SMSCs具有自我更新的能力,但是自我更新的能力会随着细胞代次的升高而减弱。核型分析结果表明,染色体形态正常,没有变异情况的发生。RT-PCR鉴定结果表明,细胞表达CD29、CD44、CD73和CD90,不表达CD34和CD45;免疫细胞化学(IF)鉴定结果表明,细胞表达CD29、CD44、CD71、CD73、CD105和CD166,不表达CD34和CD45;流式细胞术表面标记物阳性率分析结果表明,细胞表面标记物CD29、CD44、CD90、CD105和CD166阳性率均在98%以上。北京油鸡SMSCs可在IBMX、胰岛素(INS)、地塞米松和吲哚美辛等因子的作用下,向脂肪细胞诱导分化,脂滴可被油红O染液染为红色,RT-PCR检测,细胞表达LPL与PPARG这两种特异性基因;在地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸(VC)等因子的作用下向成骨细胞诱导分化,钙结节可被茜素红染液染为红色,经RT-PCR检测,细胞表达COL1A2和RUNX2这两种特异性基因;在胰岛素(INS)、L-脯氨酸、地塞米松、丙酮酸钠、TGF-β3和抗坏血酸(VC)作用下可向成软骨细胞诱导分化,细胞结节可被阿利新蓝染液染为蓝色,经RT-PCR检测,细胞表达COL2A1和VIM这两种特异性基因。诱导分化实验结果表明,北京油鸡SMSCs具有多向分化潜能,可在不同因子的作用下,向脂肪细胞,骨细胞和软骨细胞诱导分化。结论:本试验成功分离出了北京油鸡SMSCs,能在体外稳定传代至P29,并对其进行生物学特性研究和诱导分化能力鉴定,说明其具有自我更新能力和多向分化潜能,在技术上为我国畜禽种质资源保存提供支持,在成果上为国家建立建设种质资源库做出贡献,在创新上为医学、生物学领域研究奠定实验基础。
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