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天冬氨酸蛋白酶（aspartic proteases,APs）是蛋白水解酶家族中非常重要的亚家族成员,它在蛋白质的储存和降解、有性生殖、衰老和PCD（programmed cell death）以及逆境胁迫响应等生理过程中发挥重要作用。本研究以毛白杨为材料,对毛白杨天冬氨酸蛋白酶（PtoAED3）如何参与调节木质部发育以及PtoAED3是否具有类似于DUBs（deubiquitinating enzymes）特异地解离共价结合的Ubs的功能进行研究,利用转基因技术、实时荧光定量PCR、组织化学、GFP荧光标记、免疫化学等实验方法对PtoAED3在木质部细胞中细胞壁的形成进行分析,建立了无染色的石蜡切片拉曼成像方法用于观测木质部区域中木质素含量的变化。使用泛素化抗体对毛白杨材料中全蛋白泛素化含量进行测定。以上结果均表明PtoAED3参与水解次生木质部细胞壁合成的相关蛋白,影响了次生木质部中木质素含量,并且调节植株体内全蛋白泛素化含量。本研究得到了以下主要研究结果:（1）对PtoAED3的定位表达进行分析,通过检测PtoAED3基因表达量,显示PtoAED3在根、茎、叶均有表达。进一步通过Pro PtoAED3::GUS检测了PtoAED3基因组织定位,定位在叶柄、茎、根中的维管组织中,腋芽部位侧生分生组织中也存在着GUS报告基因表达。p Green-Pro PtoAED3-CDS-GFP体外GFP荧光标记并结合PGIP2-CFP共定位均显示PtoAED3定位于烟草下表皮细胞的细胞壁中,免疫胶体金实验同样发现PtoAED3主要定位在木质部木纤维细胞、木射线细胞和导管细胞次生壁中。它可能广泛参与植物各个组织生长发育,尤其是与次生木质部中细胞次生壁的形成相关。（2）为了研究PtoAED3体内生物学功能,利用农杆菌介导叶盘法,获取PtoAED3转基因材料,利用q RT-PCR和特异性抗体anti-PtoAED3的Western blotting对表达量进行检测,获得了4个过表达正义株系、5个反义抑制株系,选取了表达量差异显著的材料进行不同时期的生长高度统计分析,其中反义（AS-2）材料在各个时期植株高度均低于同期的野生型材料;过表达（OE-3）材料在一月龄和三月龄植株高度均低于同期的野生型材料,随着植株进一步生长到三月龄和移栽后六月龄实生苗时,OE-3植株高度开始高于同期野生型。石蜡切片显示反义（AS-2）材料木质部区域厚度明显低于同时期野生型;过表达（OE-3）材料木质部区域厚度在一月龄时期低于同时期野生型,而三月龄高于同时期野生型。这些结果表明PtoAED3蛋白定位在细胞壁上影响了木质部区域中木质素含量。（3）利用转录组揭示PtoAED3作用机制,结果表明在过表达材料中过氧化物酶表达量上调,尤其是与细胞壁相关的Ⅲ类的过氧化物酶上调,主要体现在木质素总含量的变化上,而抑制材料中过氧化物表达量下调,检测的差异基因中漆酶基因也下调,都显示木质素含量下调。此外,差异基因主要参与苯丙烷生物合成、植物激素信号转导及蛋白质加工,其中苯丙烷生物合成途径主要包括过氧化物酶、小檗碱桥酶、咖啡酸3-O-甲基转移酶等木质素合成相关的酶,影响了细胞壁,而植物激素信号主要体现在生长素应答蛋白,影响生长素的合成和转运,导致植物的生长发育,最后蛋白质加工主要存在于分子伴侣热激蛋白家族,说明天冬氨酸蛋白酶参与了与细胞壁形成相关的蛋白底物的加工,影响了植物的次生木质部的发育。（4）确立了无染色的石蜡切片方法用于拉曼成像分析毛白杨材料中木质部区域中木质素含量的变化。将芳香环伸缩振动引起的在1600cm-1左右处的特征峰检测植物木质素含量,相对于野生型毛白杨植株,过表达株系中木质素含量上调,而抑制表达株系中木质素含量下调。选取木质素总量上调和下调最显著的过表达（OE-3）和反义（AS-2）PtoAED3转基因株系,并通过乙酰溴法比较了转天冬氨酸蛋白酶毛白杨材料木质素含量的变化,其中木质素总量过表达（OE-3）和反义（AS-2）相较于同时期的野生型分别上调了34.82%和下调了29.46%。（5）检测了毛白杨植株和悬浮细胞全蛋白泛素化含量,其中过表达OE-3株系中明显下降,而反义AS-2株系中上调不明显。确定了不同时间下悬浮细胞中全蛋白泛素化水平变化,悬浮细胞培养6d后全蛋白泛素化水平趋于稳定;当抑制剂MG132浓度大于0.08m M全蛋白泛素化水平趋于稳定;在确立的全蛋白饱和泛素化水平下通过MG132、Pepstatin A、Leupeptin三种抑制剂处理过表达OE-3悬浮细胞,均能有效恢复悬浮细胞中全蛋白泛素水平。本研究克隆了毛白杨PtoAED3基因,通过组织定位和亚细胞定位发现该基因在不同组织,特别是定位木质部不同细胞的细胞壁上表达,可能与植物发育有密切关系;通过组织切片观察了植株木质部区域,发现反义抑制株系中木质部区域明显变小,正义过表达株系中木质部区域变大;通过拉曼光谱和乙酰溴检测了木质素含量,不同转基因材料中木质素含量差异明显,过表达植株中木质素含量显著增多,反义抑制植株中木质素含量显著下调;过表达植株中分枝增多的形态表型明显,通过泛素蛋白抗体检测发现转基因毛白杨植株全蛋白泛素化存在显著差异,推测天冬氨酸蛋白酶可能具有类似于形成泛素-蛋白酶复合体（UPS）参与降解了影响分枝的底物。