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第一部分SARM1蛋白水平与脑缺血再灌注损伤的相关性研究目的:通过检测α和Toll/白细胞介素1受体结构域蛋白1（Sterile alpha and Toll/interleukin-1 receptor motif-containing 1,SARM1）在脑缺血再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）后蛋白水平的变化来研究SARM1与脑I/R损伤的相关性。方法:实验一:构建成年雄性SD大鼠（250-300g）大脑中动脉阻塞/再灌注（Middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）模型,采用蛋白质免疫印迹实验（Western blot,WB）来评估MCAO/R大鼠脑组织半暗带区域SARM1蛋白水平的变化,通过免疫荧光染色（Immunofluorescent staining,IF）来观察大鼠MCAO/R后SARM1在半暗带区域的细胞定位以及蛋白水平变化。实验二:建立大鼠原代神经元氧气葡萄糖剥夺/复氧复糖（Oxygen-glucose deprivation/reoxygenatio,OGD/R）模型,采用WB和IF来评估OGD/R神经元中SARM1蛋白水平的变化。结果:实验一:WB结果显示,SARM1的蛋白水平在MCAO/R后2h明显升高,大约为假手术（sham）组水平的1.5倍;在4h明显下降,大约为sham组水平的0.6倍;在6-24h存在波动,但都没有统计学意义上的改变。IF发现SARM1主要表达于半暗带区域内的神经元中,且其蛋白水平与上述WB结果相似。该部分实验中大鼠死亡率为13.33%（6/45）。实验二:WB显示培养的原代神经元中SARM1蛋白水平在OGD/R后1h明显升高,大约为对照（control）组的2倍,在2-24h内存在波动,但无水平改变。IF结果与上述WB结果相似。结论:大鼠MCAO/R后,半暗带区域脑组织中SARM1水平在2h时升高,4h时降低;SARM1主要表达于神经元中;神经元OGD/R后,SARM1水平在1h升高最明显;SARM1蛋白水平与脑I/R损伤存在相关性。第二部分SARM1及其磷酸化对脑缺血再灌注后急性脑损伤及长期行为学的影响目的:通过转染野生型（Wild-type,WT）以及丝氨酸548丙氨酸点突变型（Serine 548 alanine,S548A）两种SARM1过表达慢病毒来研究I/R后SARM1及其磷酸化对急性脑损伤及长期行为学的影响。方法:构建WT和S548A两种SARM1过表达慢病毒。实验一:将两种慢病毒转染到体外培养的大鼠原代神经元中,采用WB分别在正常和OGD/R后1h的情况下来检测慢病毒转染效果以及内源性、外源性SARM1蛋白水平变化。实验二:将两种慢病毒原位注射在大鼠的半暗带区域,采用WB在MCAO/R后2h来检测慢病毒转染效果和SARM1及其磷酸化水平;用FLUORO-JADE-B（FJB）染色在MCAO/R后2h来检测SARM1及其磷酸化水平对大鼠半暗带区域神经元变性情况的影响;用2,3,5—氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色在 MCAO/R后24h来检测SARM1及其磷酸化水平对大鼠脑梗死体积的影响;用转棒实验、贴纸实验和水迷宫实验三种行为学检测方法在MCAO/R后1d-27d来评估SARM1及其磷酸化水平对大鼠MCAO/R后行为学的影响。结果:实验一:WB 结果显示,野生型 Greenfluorescentprotein（GFP）-SARM1（WT）和点突变型GFP-SARM1（S548A）都在正常以及OGD/R 1h的情况下表达。内源性SARM1蛋白水平在OGD/R后1h上升。外源性SARM1蛋白水平在OGD/R后1h也上升,但上升程度无统计学意义。实验二:WB结果显示,野生型GFP-SARM1（WT）和点突变型GFP-SARM1（S548A）都在MCAO/R2h的情况下表达。内源性SARM1蛋白水平以及SARM1 S548位点的磷酸化水平均在MCAO/R后2h上升。野生型GFP-SARM1（WT）在MCAO/R后也发生了显著的磷酸化,而点突变型GFP-SARM1（S548A）能避免这种磷酸化的发生。FJB染色结果显示,野生型GFP-SARM1（WT）加剧了大鼠半暗带区域内神经元的变性,而点突变型GFP-SARM1（S548A）能够减少神经元变性。TTC染色结果显示,野生型GFP-SARM1（WT）增大了大鼠脑梗死体积,而点突变型GFP-SARM1（S548A）不仅没有增大反而减小了脑梗死的体积。转棒实验结果显示,野生型GFP-SARM1（WT）组大鼠的转帮持续时间较短,运动功能恢复得较差,而点突变型GFP-SARM1（S548A）组的大鼠能够更有效地恢复。贴纸实验结果显示,野生型GFP-SARM1（WT）组大鼠感受及去除贴纸所用时间较长,感觉及运动功能恢复得较差,而点突变型GFP-SARM1（S548A）组的大鼠能够更有效地恢复。水迷宫实验结果显示,点突变型GFP-SARM1（S548A）能够有效改善MCAO/R诱导的空间认知功能障碍,主要体现在明显缩短的逃逸时间和较多的穿台次数上,这分别代表了空间学习和记忆功能的改善,而野生型GFP-SARM1（WT）则有相反的效果,起到了恶化空间认知功能的作用。该部分实验中大鼠死亡率为11.57%（14/121）。结论:I/R后,SARM1在S548位点的磷酸化水平上升;S548A点突变可以有效阻止SARM1的磷酸化;阻止SARM1的磷酸化能够改善大鼠I/R后的急性脑损伤和长期行为学。第三部分脑缺血再灌注模型中SARM1磷酸化的调控机制目的:研究I/R后SARM1及其磷酸化对神经元亚细胞结构的影响和调控SARM1磷酸化的潜在机制。方法:实验一:转染两种SARM1过表达慢病毒后,采用IF来检测OGD/R后1h慢病毒转染效果、外源性GFP-SARM1形态以及神经元轴突长度的变化。实验二:加入JNK抑制剂（JNK-I）后,采用WB来检测OGD/R后1h JNK及其磷酸化和SARM1及其磷酸化水平。结果:实验一:IF结果显示,两种外源性GFP-SARM1均转染成功。在正常情况下,GFP-SARM1（WT）和GFP-SARM1（S548A）形态及分布类似,都较小且均匀分布。在OGD/R 1h后,GFP-SARM1（WT）形态较大,聚集在细胞核周围,在轴突中少见,而GFP-SARM1（S548A）则形态较小,在神经元体和轴突中均匀分布。GFP-SARM1（S548A）组神经元的轴突较长且较完整,GFP-SARM1（WT）组神经元则相反。实验二:WB结果显示,OGD/R 1h后,JNK磷酸化水平（p-JNK）和JNK蛋白水平均明显增加,JNK抑制剂能够显著降低p-JNK和JNK水平。另外,SARM1在S548位点的磷酸化水平（p-SARM 1）以及蛋白水平也在OGD/R后明显上升。与OGD/R组相比,JNK抑制剂明显降低了 SARM1的磷酸化水平。结论:SARM1磷酸化抑制线粒体沿轴突转运,加重轴突损伤;JNK磷酸化介导S ARM 1磷酸化。