论文部分内容阅读
H9N2亚型禽流感病毒在我国自1994年被首次分离以来,进化出了以A/chicken/Beijing/1/1994（BJ/94-like）、A/quail/HongKong/G1/1997（G1-like）、A/chicken/Shanghai/F/1998（F/98-like）等为代表株的多个基因谱系和多种基因型。其中,在F/98-like病毒骨架上同时替换入G1-like PB2和M基因的S（G57）基因型H9N2自2010年以后持续占据优势流行地位,并频繁为H7N9、H5N6和H10N8等新型重组病毒提供整套内部基因,对养殖业和人类健康均构成了极大威胁。因此,本文的研究目的是探究G1-like PB2、M基因是否对S基因型H9N2禽流感病毒的生存优势及其充当新型重组病毒内部基因供体的竞争优势方面造成影响。本研究一方面在S基因型H9N2病毒 A/Chicken/Anhui/AH320/2016（AH320）的骨架上替换F/98-like的PB2、M基因,对比其与G1-like PB2、M基因在影响重组H9N2病毒生存优势方面的贡献;并进一步基于G1-like与F/98-like PB2基因vRNA包装信号序列的差异,构建含有嵌合型PB2的重组H9N2病毒,评价包装信号序列对PB2基因的蛋白表达能力和RNA合成水平以及对H9N2病毒复制能力、共感染中竞争优势以及在鸡体内的复制和排毒的影响。另一方面,在H7N9病毒 A/Chicken/Guangdong/15/2016（GD15）的骨架上替换 F/98-like和G1-like来源的PB2、M基因,从病毒粒子竞争性包装的角度探讨S基因型H9N2病毒作为其他新型重组流感病毒内部基因供体的可能优势。1.以9种质粒共转染、病毒共感染实验比较G1-like PB2和F/98-like PB2基因的竞争优势为探究G1-like PB2基因在S基因型H9N2禽流感病毒形成稳定优势流行方面是否具有影响,我们一方面在质粒水平,以AH320病毒的PB1、PA、NP质粒搭配其自身或F/98-like的PB2质粒,分别于共转染293T细胞48h后以western-blot和qPCR方法定量细胞中不同PB2基因在蛋白表达和RNA合成水平的差异。结果显示,G1-like与F/98-like PB2具有相似的vRNA、cRNA、mRNA合成水平,但G1-like PB2可引起更高的蛋白表达水平。另一方面,在病毒水平,将拯救的WT-AH320和PB2基因被替换为F/98-like的重组病毒AH320-PB2sH14进行对比研究。首先以TCID50/HA滴度比值的高低来评价感染性病毒颗粒产生的效率,其次比较了空斑纯化前后病毒在MDCK细胞上的复制能力,然后又以两病毒共感染MDCK细胞并经NH4C1阻断新生病毒粒子再次进入细胞的方式测定了不同PB2基因的拷贝数。结果显示,WT-AH320较AH320-PB2SH14含有更高比例的感染性病毒颗粒;空斑纯化后两病毒的复制水平均显著提升,且AH320-PB2SH14可在感染MDCK细胞后48～72h达到与WT-AH320相似水平;两病毒以1MOI感染MDCK细胞48h,单独感染时细胞和上清中两种PB2基因的数量差异不显著,然而共感染时,细胞和上清中G1-like PB2基因拷贝数均显著高于F/98-like PB2基因。2.G1-like PB2基因包装信号对S基因型H9N2禽流感病毒优势流行的影响通过比对流感数据库中G1-like与F/98-like PB2基因,发现二者氨基酸序列较为相似但核苷酸序列差异明显,包括3’和5’端的包装信号区域。为进一步明确G1-like PB2基因包装信号序列对S基因型H9N2禽流感病毒形成优势流行的影响,我们分别以第一章中构建的WT-AH320和AH320-PB2sH14为骨架,进行G1-like与F/98-like PB2基因3’和/或5’包装信号序列的互换并排除44和676位氨基酸有义突变的干扰,成功获救出以下重组病毒:AH320-PB2aS（PB2SH143’端替换为 AH320）、AH320-PB2Sa（PB2SH145’端替换为 AH320）、AH320-PB2aSa（PB2SH143’和 5’端均替换为 AH320）和 AH320-PB2As（PB2AH3205’端替换为 SH14）;AH320-PB2mutAH（PB2AH320第44和676位氨基酸均替换为SH14）和AH320-PB2mutSH（PB2SH14第44和676位氨基酸均替换为AH320）。接下来,针对上述重组病毒和母本病毒,一方面在体外进行了 PB2基因的蛋白表达和RNA合成水平、病毒在细胞上的复制能力以及共感染状态下病毒感染性颗粒形成能力的测定;另一方面,以106.0 EID50剂量通过滴鼻点眼途径感染5周龄SPF鸡进行了体内实验。体外实验结果显示,PB2Sa、PB2aSa和PB2mutSH的RNA合成能力和蛋白表达水平均显著提高,而PB2As、PB2sAs,PB2mutAH则不同程度下降;将PB2SH14的3’或5’端包装信号替换为G1-like后显著提高了重组H9N2病毒在MDCK和CEF细胞上的复制能力,而将PB2AH320的3’端包装信号替换为PB2SH14后则导致重组病毒的复制性能降低;与WT-AH320共感染时,AH320-PB2aSa可显著提高其细胞和上清中嵌合PB2基因的比例,而AH320-PB2As则导致显著降低。动物实验结果显示,将PB2SH14 3’和/或5’端包装信号替换为PB2AH320的重组H9N2病毒以及AH320-PB2mutSH均可不同程度地增加其在肺脏和脑中的检出率;此外,与AH320-PB2SH14相比,上述突变病毒的排毒时间均延长至攻毒后第7天,且其通过粪便排出活病毒的几率得到了明显增强。然而,将PB2AH320 3’端包装信号替换为PB2SH14的重组H9N2病毒以及AH320-PB2mutAH与WT-AH320病毒相比,排毒时间均未能持续到攻毒后第7天。3.H7N9背景下不同H9N2来源的G1-like PB2和M基因与F/98-like PB2和M基因的竞争包装由于第一章研究发现不同H9N2病毒共感染时G1-like PB2相对于F/98-like PB2更有竞争优势,且实验室前期的研究还发现G1-like PB2和M基因可以提高H5NX和H7N9禽流感病毒在鸡和小鼠体内的适应性,然而,作为供体基因G1-like PB2和M基因是否在H7N9病毒的背景下仍具有竞争优势不得而知。因此,我们以H7N9病毒株GD15为骨架,比较了不同H9N2毒株来源的G1-like和F/98-like M、PB2基因的竞争包装情况。即在GD15病毒背景下,以不同毒株（GD15、A/Chicken/CZ73/2014（CZ73）、AH320）来源的 G1-like M 或/和 PB2质粒外加SH14来源的F/98-like M或PB2,9质粒共转染293T细胞,72h后取上清接种SPF鸡胚后,以qPCR检测拯救病毒中G1-like和F/98-like M、PB2基因的拷贝数。为排除病毒复制水平差异对实验结果的影响,我们将WT-GD15病毒和M/PB2基因被替换为MSH14和/或PB2SH14基因的重组H7N9病毒共感染MDCK细胞,检测G1-like与F/98-like M、PB2基因在共感染中的竞争情况。结果显示,G1-like M、PB2基因较F/98-like M、PB2基因优先包装入子代病毒粒子中。重要的是,不同毒株来源的G1-likeM、PB2基因,其竞争优势存在差异性:在与F/98-like M、PB2基因的竞争中,GD15（H7N9）来源的G1-like M和PB2基因均表现出更显著的优势,而CZ73（H9N2）毒株仅G1-like PB2基因表现显著优势,AH320（H9N2）毒株仅G1-likeM基因表现出竞争优势。4.G1-like M2蛋白对H9N2禽流感病毒优势流行的影响本研究中我们通过比对G1-like与F/98-like M基因序列,另外发现G1-like M基因在M2胞外区的第13、16、18和21位,跨膜区的第31位,胞内区的第68、82、97位也存在分支特异性的氨基酸变化。为进一步明确上述M2蛋白氨基酸变化是否与S基因型H9N2流感病毒的稳定流行有关,我们在第三章中F/98-like MSH14质粒基础上分别将上述区域的氨基酸突变为G1-like序列构建突变M质粒。一方面突变M质粒与WT-AH320病毒的PB2、PB1、PA、NP共转染293T细胞,另一方面拯救获得M基因突变的重组病毒感染MDCK细胞,并以qPCR和western-blot对上述转染和感染细胞内M基因的RNA合成和蛋白表达进行检测。结果显示:上述M2点突变均可以显著提高M1和M2基因RNA合成和蛋白表达水平,但其对重组H9N2病毒在MDCK和CEF细胞中复制能力的影响却较为有限。我们进一步对上述M基因突变的重组H9N2病毒在不同温度下的稳定性进行了测定。结果显示,以56℃检测H9N2病毒HA效价变化,待测病毒均为热稳定型。而将突变病毒分别置于42℃24h和室温72h,其HA效价下降均在2个滴度以内;室温条件下各病毒的TCID50滴度变化并无显著差异;但42℃处理24h后,WT-AH320病毒和跨膜区突变的AH320-MTM病毒,其TCID50下降滴度明显低于其他病毒,表明G1-like M2蛋白跨膜区31N有利于提高H9N2禽流感病毒在42℃的稳定性并可能对H9N2病毒的优势流行具有积极意义。综上,本文研究了 G1-like PB2及M基因对S基因型H9N2流感病毒生存优势的影响并探讨了相关机制。我们的研究结果表明,与F/98-like相比,G1-like的PB2基因更有利于H9N2流感病毒产生感染性病毒颗粒,G1-like的M2蛋白31N有利于提高H9N2病毒在42℃的稳定性。当不同H9N2病毒共感染时,G1-like相较于F/98-like,其PB2基因更具有竞争优势,且该现象在H7N9病毒中同样存在。其中,G1-like PB2基因的包装信号序列不仅有利于提高H9N2流感病毒感染性病毒颗粒的产生,而且影响PB2基因RNA的合成和蛋白表达,并有利于延长病毒在鸡体内的排毒时间,因此可能在S基因型H9N2流感病毒的优势流行中发挥重要作用。