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锌是所有生命体中继铁之后最重要的微量元素,存在于微生物及哺乳动物蛋白质中,可作为结构组成或催化因子参与催化反应、DNA合成、基因表达、免疫反应等多种生理活动。宿主和致病菌在他们的互作界面建立了一种竞争性关系:宿主通过自身锌转运及多种策略限制致病菌的锌利用,影响致病菌的生长和毒力,达到抵御致病菌感染的目的;同时多种肠道共生微生物参与锌争夺,使得肠道内致病菌锌营养受到限制。细菌在面临宿主肠道内复杂的锌限制环境时,为了满足自身营养需求并建立稳固定植,进化出了多种锌转运系统来摄取锌。因此,寻找细菌主要的锌转运摄取系统并全面了解其发挥的主要功能,可为研究新型抗菌策略或抗菌靶点提供一定的理论基础。本研究以产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic E.coli,ETEC）参考株F4ac+ ETEC C83902为主要研究菌株,探究了其在低锌环境中主要的锌转运系统,并对锌转运系统在ETEC C83902致病过程中的功能进行了探究。具体研究内容如下:1利用RNA-seq技术筛选锌缺陷条件下F4ac+ETEC C83902主要锌转运蛋白为了揭示F4ac+ETEC C83902在低锌环境下的应对策略,本研究利用RNA-seq技术对锌充足和锌限制条件下F4ac+ETEC C83902的差异表达基因（different expression genes,DEGs）进行了筛选。结果显示,与锌充足条件相比,锌缺陷条件下有505个DEGs显著上调,523个DEGs显著下调。对DEGs进行了 GO和KEGG pathway富集分析,发现这些DEGs参与细菌多种生物学过程。其中与锌转运相关且表达显著上调的基因有znuA和znuCB;与锌转运相关且表达显著下调的基因有zntA、cusA、cusB、cusC和zraP。这些数据表明,ETEC C83902在缺锌的情况下,上调锌摄取转运系统基因的表达,下调锌转出系统基因的表达,以调节自身锌动态平衡。2 ETEC C83902 ZnuACB系统缺失株的构建及该系统对细菌在低锌环境下生长的影响前期RNA-seq结果显示,ETEC C83902在锌缺陷锌条件下上调ZnuACB（Zinc uptake）锌转运系统表达。为探究该系统在ETEC C83902菌中的功能,本研究对ETEC C83902锌转运系统znuACB基因进行了测序,并利用λ-Red同源重组系统构建了 ETEC C83902AznuA、ETEC C83902ΔznuB、ETEC C83902ΔznuC单个亚单位基因缺失株和ETEC C83902ΔznuACB全长基因缺失株,并检测了上述缺失株在TPEN处理的锌缺陷条件下的生长情况。研究结果显示:在锌缺陷培养条件下,ZnuACB功能的缺失导致细菌生长受到抑制,而添加锌可以抵消缺失株的生长抑制,这表明ETEC C83902ZnuACB锌转运系统通过摄取锌维持细菌在低锌环境下的生长。3 ZnuACB系统缺失对F4ac+ETEC生物被膜形成和黏附细胞能力的影响生物被膜是细菌为了适应外界环境,由自身产生的一种菌落聚集体,以保护细菌,使其能在严峻环境中生存繁殖。为探究ZnuACB转运系统对ETEC C83902生物被膜形成能力的影响,本研究进行了生物被膜定性、定量试验。结果发现,无论是在常规生物被膜诱导培养基条件,还是在TEPN处理的锌缺陷培养条件下,ZnuACB系统功能的丧失都会导致生物被膜形成能力的下降（p<0.05）。此外,本研究探究了 ZnuACB系统对ETEC C83902黏附IPEC-J2细胞能力的影响。结果显示:在常规LB培养条件下,ZnuACB系统的缺失导致ETEC C83902黏附能力下降,但差异不显著。在锌缺陷培养基中,ZnuACB系统全长基因的缺失导致ETEC C83902黏附能力下降81%（p<0.001）,且这种降低作用在添加锌离子后得以恢复。利用qPCR检测了不同培养条件下,ZnuACB系统的缺失对ETEC C83902黏附因子亚单位基因（faeG、fimA、cpA）;肠毒素eltB;生物被膜形成相关基因（luxS、pfs）转录水平的影响。结果显示,在LB培养条件下,与WT组相比,ETEC C83902ΔznuACB组的faeG、ecpA、luxS基因转录分别下降约25%、27%、33%（p<0.05）;fimA、eltB、pfs基因转录分别下降 16%、23%、21%（p>0.05）。在TPEN处理的锌缺陷培养条件下,与WT组相比,ETEC C83902ΔznuACB组的faeG、ecpA、eltB、luxS、pfs基因转录分别下降 46%、48%、72%、46%、41%（p<0.01）,fimA基因转录上调21%（p>0.05）。综上,本研究证实ZnuACB转运系统在维持低锌条件下细菌生物被膜形成、黏附力、毒力因子表达方面发挥重要作用。4 ZnuACB系统缺失对ETEC C83902鞭毛形成及对肠上皮细胞促炎反应的影响鞭毛是细菌主要的运动器官,但也作为重要的毒力因子参与细菌的致病过程。本研究探究了 ZnuACB锌转运系统缺失对鞭毛的影响。结果显示,ZnuACB锌转运系统的缺失导致细菌运动性降低,且在锌缺陷培养条件野生株（WT）运动性也丧失,提示锌的缺乏会降低细菌运动能力。回补0.5mM Zn2+后,WT及ZnuACB转运系统缺失株运动能力均得以恢复,且WT运动性恢复更为显著;而添加1mMZn2+后,WT及ZnuACB转运系统缺失株无运动,提示过量的锌会使细菌丧失运动能力。检测与细菌鞭毛合成相关基因的表达情况,结果显示:与WT相比,在LB培养条件下,ETEC C83902ΔznuA CB菌鞭毛合成相关基因flhC、fliA、fliC表达量分别下降了 67%、90%、92%（p<0.01）;在TPEN处理的锌缺陷条件下,ETEC C83902ΔznuACB flhC、fliA、fliC表达量分别下降了 75%、75%、63%（p<0.01）。此外,炎性因子表达情况检测表明:细菌感染IPEC-J2细胞1小时后,与WT感染组相比,ETECC83902ΔznuACB感染组IL-6、IL-8、TNF-α表达水平分别下降30%、46%（p<0.05）,24%（p>0.05）;锌缺陷条件下,细菌感染IPEC-J2细胞1小时后,与WT感染组相比,ETEC C83902ΔznuACB感染组IL-6、IL-8、TNF-α表达水平分别下降31%、45%、22%（p<0.05）。细菌感染IPEC-J2细胞4小时后,与WT感染组相比,ETEC C83902ΔznuACB感染组IL-6上调12%（p>0.05）,IL-8上调15%（p>0.05）,TNF-α无明显变化;锌缺陷条件下,细菌感染IPEC-J2细胞4 小时后,与 WT 组相比,ETEC C83902ΔznuACB感染组 IL-6 下调 26%（p<0.01）,IL-8下调46%（p<0.01）,TNF-α保持不变。综上,锌匮乏或锌转运系统的缺失可以导致细菌鞭毛合成相关基因在转录水平的表达下调,造成细菌鞭毛合成障碍,使细菌运动能力降低,同时,ZnuACB系统的缺失也降低细菌感染细胞后的炎性因子表达。5体内探索ZnuACB系统缺失对F4ac+ETEC C83902致病力的影响前期体外试验研究表明,ZnuACB锌转运系统对维持ETEC C83902生长、生物被膜形成、IPEC-J2细胞黏附、运动性等致病力方面具有重要作用,尤其是在低锌环境下,影响更为突出。为探究ZnuACB锌转运系统对ETEC C83902在仔猪体内致病力的影响。本研究进行了仔猪攻毒试验,结果发现,ZnuACB锌转运系统的缺失导致ETEC C83902引起的仔猪腹泻症状减轻、粪便载菌量减少;感染仔猪小肠绒毛的损伤程度降低;诱发宿主炎性反应程度降低,进一步证实ZnuACB锌转运系统在ETEC C83902致病力方面发挥重要作用。