目的:食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,我国是食管癌的高发国家,每年因食管癌死亡的人数占全部恶性肿瘤死亡的近四分之一。目前治疗食管癌除早期手术,化学药物已成为治疗恶性肿瘤的重要方法,但是绝大多数化学药物的细胞毒作用缺乏特异性,在杀死肿瘤细胞的同时,无选择的杀伤正常细胞。因此,寻找毒副作用小,抗瘤活性强的化疗药物已成为国内外研究的热点。姜黄素是从姜黄属植物姜黄的根茎中提取的一种植物多酚,可用于食品上色及佐味。近年研究发现其药理作用广泛,如抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂、抗动脉硬化及抗肿瘤等作用。尤其姜黄素可诱导多种肿瘤细胞凋亡,作为一种具有良好发展前景的抗癌药物,日益引起人们的关注,但对人食管癌的作用及分子机制研究较少,本研究通过体外培养人食管癌Ec-9706细胞,研究姜黄素作用后细胞形态、细胞凋亡及其调控基因表达的影响,探讨姜黄素在食管癌细胞中的作用机制,为食管癌的化学防治提供实验依据。肿瘤发生不仅是瘤细胞的过度增生,还存在死亡过少,凋亡机制障碍,细胞凋亡参与肿瘤起始过程,并对肿瘤发生发展起负调控作用。本研究运用多种实验技术,对细胞凋亡中凋亡抑制蛋白因子(Livin),促凋亡因子(Smac)和Caspase-3进行检测和分析,以期进一步阐明细胞凋亡调控基因在肿瘤发生发展中的作用。方法:将Ec-9706细胞于37℃,饱和湿度5%CO2的常规条件下培养,待细胞进入对数生长期后用于实验。1应用光镜观察细胞形态学变化:将不同浓度的姜黄素作用于Ec-9706细胞,在倒置相差显微镜下定时观察细胞的生长情况并照相。2采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测药物对细胞的生长抑制作用。3流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡、细胞周期分布:收集经不同浓度姜黄素作用12h、24h、48h的Ec-9706细胞及对照组细胞,冷PBS漂洗。预冷70%乙醇4℃,固定,上机检测前离心去固定液,0.5%胃蛋白酶消化,碘化丙锭(Propidium Iodide,PI:50mg/L Trinton X-100 1.0%)室温避光染色。流式细胞仪上机检测,应用软件进行分析。4 FCM检测caspase-3蛋白的表达:收集经不同浓度姜黄素作用12h、24h、48h的Ec-9706细胞及对照组细胞,按常规方法进行荧光标记,流式细胞仪检测荧光强度,以荧光指数(FI)表示蛋白的表达情况。5应用免疫细胞化学方法观察细胞凋亡调控因子Smac、Caspase3蛋白表达的变化。6 western blot半定量检测基因蛋白Livin、Smac、Caspase3表达,并分析各蛋白表达之间的相关性及其在姜黄素抗食管癌中的作用机制。结果:姜黄素对Ec-9706细胞凋亡及其调控基因的影响1经40、80、120、160μmol /ml姜黄素处理Ec-9706细胞12h、24h和48h后,倒置相差显微镜下观察,与对照组相比,用药组的细胞生长明显被抑制,胞浆内颗粒增多增粗,核浆比例降低,部分细胞变圆而悬浮在培养基内。提示Ec-9706细胞趋于凋亡。2分别用姜黄素(0、40、80、120、160μmol /ml)作用于Ec-9706细胞12、24、48h,MTT结果显示姜黄素能明显抑制Ec-9706细胞的增殖,并呈剂量和时间依赖性。作用12h、24h和48h后, Ec-9706细胞半数抑制率(inhibitory concentration giving 50% inhibition , IC50)分别为216.1447μmol/ml , 148.0635μmol/ml和113.8045μmol/ml(p<0.01)。最高增殖抑制率为:应用160μmol /ml姜黄素处理Ec-9706细胞48小时后,其增殖抑制率达到73.19%。溶剂对细胞生长未见明显影响(P>0.05)。3流式细胞仪分析细胞凋亡,在DNA组方图上出现典型的亚二倍体峰即“凋亡峰”。40、80、120和160μmol /ml姜黄素作用12 h后的凋亡率分别为6.01±1.04%、9.26±2.11%、13.31±1.54%和20.16±2.85%,与对照组的1.70±0.32%相比,差异有显著性(P<0.05)。药物作用24h后的凋亡率分别为8.74±0.98%、11.63±1.74%、21.67±2.34%、36.17±2.78%,与对照组的2.12±0.48%相比,差异有显著性(P<0.01)。药物作用48h后凋亡率分别为9.14±1.62%、17.74±1.87%、30.82±2.48%和44.35±3.42%,与对照组的2.87±0.54%相比,差异有显著性(P<0.01)。并做各用药浓度组作用不同时间细胞凋亡率的方差分析,表明差异有显著性(P<0.05)。pearson关联性分析,剂量依赖(r=0.8371,P<0.01)与时间依赖(r=0.6912,P<0.01)。说明Ec-9706细胞凋亡率与姜黄素作用呈剂量和时间依赖关系。姜黄素作用后,Ec-9706细胞在细胞周期中的分布发生了明显的变化,随着作用时间延长和药物浓度的增加,G0/G1期细胞数逐渐增加,S和G2/M期细胞数逐渐减少。经药物浓度和作用时间方差分析,差异有显著性(P<0.05)。pearson关联性分析,剂量依赖(r=0.7147,P<0.01)与时间依赖(r=0.6912,P<0.05)。4 FCM检测姜黄素作用后Caspase-3蛋白表达用0、40、80、120和160μmol /ml姜黄素处理细胞,于12、24h和48h收集细胞,用流式细胞仪检测Caspase-3蛋白表达。Caspase-3蛋白平均荧光指数(FI):12h组蛋白表达分别为(1.00±0.00) (1.05±0.07) (1.18±0.04) (1.23±0.09) (1.72±0.11);24 h组分别为(1.00±0.03) (1.27±0.04) (1.43±0.04) (1.89±0.07) (2.11±0.13) ;48h组分别为(1.00±0.02) (1.31±0.05) ( 1.81±0.03) (2.09±0.08) (2.35±0.07),与对照组比较,均有显著性差异(P<0.01)。随着药物浓度、作用时间的增加,Caspase-3表达逐渐增高,呈正相关关系,剂量依赖(r=0.8722,P<0.01),时间依赖(r=0.7261,P<0.05)。5 0、40、80、120、160μmol /ml姜黄素对Ec-9706细胞分别作用12、24、48h小时后进行免疫细胞化学检测,对照组中,Smac和Caspase3蛋白在细胞中呈弱阳性表达,姜黄素作用后,细胞中的蛋白表达水平明显升高。6 western blot半定量检测基因蛋白表达,随着姜黄素药物浓度的增高,Smac、Caspase3表达水平逐渐升高,Livin表达水平逐渐降低,而且有明显的量效依赖关系。结论:1姜黄素可明显抑制人食管癌Ec-9706细胞的增殖,并使细胞周期受到阻滞,进一步诱导肿瘤细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤作用。抑制细胞增殖与诱导凋亡呈时间和剂量依赖关系。2人食管癌Ec-9706细胞中存在Livin蛋白的高表达,姜黄素作用后Livin蛋白表达显著下调,减弱了其对细胞凋亡的负性调控,从而诱导肿瘤细胞凋亡。3姜黄素作用后Smac蛋白表达上调, Smac蛋白表达水平增高,促进了解除livin对Caspase的抑制效应而激活procaspase-3,成为有活性的Caspase-3,发挥其诱导肿瘤细胞凋亡的作用。4 Caspase-3蛋白随药物浓度的增高及作用时间的延长而表达量明显升高。Caspase-3经蛋白水解作用而被激活,从而产生了Caspase自我放大级联反应,进而裂解DNA损伤细胞,发生肿瘤细胞的凋亡。