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蛋白酶是生物体内蛋白质降解的主要参与者,组织蛋白酶（cathepsin）是广泛存在于各种动植物组织细胞内（特别是溶酶体部分）的一类蛋白酶,并在所有生物体中均扮演着非常重要的角色。对组织蛋白酶最初的观点认为其仅仅是作为一种蛋白酶而发挥作用,但是近年来随着研究的不断深入,组织蛋白酶已被认为是木瓜蛋白酶超家族中最重要的组分,因为它们在细胞蛋白质降解中发挥重要的作用,此外,组织蛋白酶为一个庞大的蛋白酶家族群,拥有几十个家族成员,其功能也不尽相同。组织蛋白酶L（Cathepsin L）,它是一种半胱氨酸蛋白酶,并且作为木瓜蛋白酶家族的主要成员,其参与了许多的生理过程,例如,组织重塑,牙齿运动,肿瘤发生发展及免疫等。目前,有关昆虫组织蛋白酶的研究明显滞后于哺乳动物,尤其是有关家蚕组织蛋白酶的研究,仍处于起步阶段。家蚕作为鳞翅目昆虫的典型代表生物模型,对昆虫的研究具有极大的指导作用。因此,本研究,我们选取在家蚕中研究组织蛋白酶L（BmCathepsin,BmCat L）基因,这为进一步揭示组织蛋白酶L基因的功能以及作用机理非常必要。本研究通过家蚕基因组数据库（Silkworm Genome Database）、NCBI数据库以及EST数据库等综合分析,运用RACE技术成功获得了该基因的两个不同剪切体;利用相关软件对其进行了生物信息学的分析和进一步鉴定;通过实时荧光定量PCR对该基因在家蚕不同龄期以及不同组织的表达情况进行了检测分析;作为一种蛋白酶,同时也对其内外源酶活性以及影响因素进行了测定;最后,为进一步探索Bm Cat L的功能,通过活体攻毒实验,揭示其在家蚕免疫调控中可能具有的作用。主要研究成果总结如下:1.BmCaL全长克隆及生物信息学分析利用家蚕基因组数据库、NCBI以及日本家蚕数据库等在线工具对Cathepsin L基因进行基本的信息比对以及分析,设计引物,利用RACE技术,成功克隆得到家蚕Cathepsin L全长cDNA序列。通过比对分析发现,家蚕Cathepsin L存在两种长度不同的剪切体形式,分别命名为BmCathepsin L-L（BmCat L-L）和BmCathepsin L-S（BmCat L-S）。两种剪切体均含有完整的开放性阅读框（ORF）,其大小分别为1664bp和687bp,分别编码556和228个氨基酸,预测蛋白分子量为62.471KDa和26.132 KDa,理论等电点为4.86和4.57。该基因的两种剪切体的预测蛋白结构非常相似,均有一个组成完全相同的信号肽、一个组织蛋白酶L典型的Inhibitor129结构域和PeptC1结构域。将该基因的不同剪切体与其他物种进行比对分析,然后构建NJ进化树,结果显示该基因在长期进化过程中极高的保守性。通过Robetta软件计算预测该基因蛋白的三维结构,再运用蛋白数据库进行比对,结果显示该基因与黄粉虫中肠蛋白组织前酶L的三维结构非常相似,预测该蛋白酶在蛋白消化降解方面所具有的功能。2.BmCat L的表达分析通过qRT-PCR技术对该基因在家蚕幼虫L5D3不同组织和不同龄期血液组织蛋白酶L基因的表达情况进行检测。各组织表达结果显示BmCat L-L基因和BmCat L-S均在血液中高量表达,两剪切体在头部组织中低量表达,BmCat L-L在精巢中有少量表达,此外两者在其他组织中几乎检测不到其表达量。为了进一步研究血液的这种特异性高量表达,针对不同龄期的血液组织进行了定量检测,结果显示从幼虫L4D2至PP2的过程中,BmCat L均维持在一个相对较高的表达水平,并随着变态进程的推进两种剪切体的表达变化有着明显的差异性变化,BmCat L-S在幼虫L4M时表达量达到了一个峰值;而BmCat L-L则在L4D4时表达量同样达到一个峰值,随后BmCat L-S的表达量会随着龄期的变化逐渐降低,最后趋近于不表达;相对BmCat L-S而言,BmCat L-L的表达量也会随着龄期的变化而降低,但其表达水平却始终维持在一定的表达范围内。通过对两种不同剪切体于血液组织不同龄期表达谱的检测分析,预测BmCat L在家蚕血液中处于高表达的状态,并在变态发育过程中似乎扮演着表达互补的作用,且可能影响家蚕的变态和发育,但具体机制还有待进一步验证。3.BmCat L原核表达、重组蛋白纯化及抗体制备选取该基因ORF的特异性片段,构建原核表达载体。在不同温度和IPTG浓度下摸索诱导得到最佳表达条件,选择在该条件下进行大规模诱导,经高压破菌,运用Ni+亲和层析法纯化重组蛋白;为了进一步验证纯化后的重组蛋白为目标蛋白,运用His抗体进行Western blot杂交实验验证,并成功获得了相应大小的目的条带。最后,利用纯化的重组蛋白对昆明鼠进行多次免疫,获得该基因的抗血清蛋白,通过ELISA、免疫荧光和免疫印迹实验均验证了该抗体的可用性,这为后期功能以及机制的研究奠定了基础。4.BmCat L的活性、稳定性以及影响因素测定取L5D3家蚕血液组织提取组织蛋白酶,然后对其内源性组织蛋白酶的活性及稳定性特征进行测定分析。利用不同组织蛋白酶的特异性检测底物对家蚕血液组织不同组织蛋白酶的活性进行测定,发现被检测的三种组织蛋白酶（B、L、H）活性均受温度、pH等因素的影响;热稳定性测定结果显示,当温度高于75℃时,被检测的三种酶几乎都处于活性丧失状态,当将酶置于常温状态下,其活性也随着时间逐渐变弱。综合测定结果显示组织蛋白酶B是一种偏酸活性酶,最适pH大约为5.5,最适温度为37℃,组织蛋白酶L最适pH约为4.0-5.0,最适温度为37℃,而组织蛋白酶H最适pH为8.0,最适温度为37℃。通过利用相同的方法对纯化后的重组组织蛋白酶L进行了检测,发现重组蛋白酶只对其特异性反应荧光底物Z-phe-Arg-Nmec具有酶活性功能,进一步说明纯化所得的蛋白酶为具有活性的组织蛋白酶L;对酶活性以及稳定性的检测结果均显示出外源组织蛋白酶L具有同内源组织蛋白酶L相似的酶学特征。以上的研究结果将为家蚕蚕病、尤其是血液疾病的防治及检测提供理论参考,同时,我们研究工作也丰富了家蚕组织蛋白酶酶学研究的内容,作为对鳞翅目的代表家蚕进行研究,对其它鳞翅目昆虫在该领域的研究极具指导意义。5.BmCat L功能初步探索组织蛋白酶L作为一类蛋白酶,除了具有消化降解的作用外,另据大量研究报道,其在生物体免疫中具有不可或缺的作用。然而,通过前面的研究已然显示,组织蛋白酶L基因在家蚕血液组织中存在着特异性地高量表达,血液组织是昆虫最为重要的免疫器官,许多研究报道其组份对于昆虫的免疫调控起着至关重要的作用,家蚕作为鳞翅目昆虫,如同其他昆虫一样,先天性免疫是它们抵御病原体的入侵,并维持自身稳态最为关键的防御体制。那么,组织蛋白酶L在家蚕血液组织中的这种高量表达是否也预示着其免疫相关的功能?其实这并未知晓。于是通过选择不同的致病菌和致病模式因子,对家蚕进行了活体攻毒验证,结合RT-PCR实时监测,结果显示,在保证蚕体安全剂量的情况下,BmCat L的表达量会首先随着攻毒时间的变化而达到一个峰值,随后,其表达量又会回到一个正常表达的水平。通过比较分析,BmCat L的两种剪切体趋势基本一致,推测其可能参与家蚕的血液免疫调控。