近些年兴起的基于高通量测序技术的微生物检测在基础医学研究领域促进了人体微生物组学尤其是肠道微生物组学的快速发展,同时也为临床感染性疾病的诊断提供了一种新的不依赖微生物培养的病原体广覆盖检测策略。目前用于人体微生物组研究的两个主要的方法是16S rRNA基因测序（16Ss）和鸟枪法宏基因组测序（SMs）。前者通过靶向扩增和测序细菌的16S rRNA基因的高变区来鉴定和分类微生物,在研究各类人群的肠道菌群多样性时被广泛使用。后者则能够对样本中所有微生物的基因组序列同时测序,在微生物鉴定方面不仅能将已知的物种鉴定到种或亚种水平,同时还可以利用基于序列从头组装的方法重建迄今为止未能培养物种的基因组。在临床感染性疾病诊断领域中,目前正逐渐被广泛应用的基于高通量测序的宏基因组检测（mNGS）则侧重于对样本中感染相关病原体的鉴定。然而,尽管以上技术在微生物检测中发挥着越来越重要的作用,但它们作为流程复杂、处于进化中的先进技术,目前尚缺乏标准化的检测流程,实验过程中的多种变异因素影响着检测结果的稳定性和准确性。同时由于缺乏具备临床样本特征的参考物质,尚无法通过开展大规模的质量评价研究以明确各实验室在常规检测条件下检测相同的样本时所得结果的可比性。本研究则在此背景下,通过制备符合临床标本特征（考虑微生物组成及影响高通量测序的关键样本背景因素）且适用于上述高通量测序技术的参考物质,分别对国内开展肠道菌群多样性分析及病原体鉴定的高通量测序实验室进行了多中心质量评价研究,用以评估各实验室的检测结果的准确性及实验室间结果的可比性,分析变异来源并讨论可能的解决方案,旨在促进实验室检测方案的进一步优化、整合及标准化。在第一部分中,我们设计了符合人类肠道菌群特征的4个模拟群落样本及一个阴性质控样本作为参考物质,对国内35个常规开展肠道菌群高通量测序（含有16Ss和SMs）的独立实验室进行了多中心质量评价研究。研究结果发现,从样本处理到最终的数据分析过程,各参加实验室使用的方法学细节存在很大的差异。总体上,分别有46.2%（12/26）的16Ss实验室和82.6%（19/23）的SMs实验室在模拟群落样本201901中检测到的微生物组成与预期结果呈中度或高度的显著相关（Spearmanr>0.59,p<0.05）。采用相似或相同方案的实验室的结果显示出较轻微的实验室间差异。具体到特定的微生物,不同实验室观察到的相对丰度的差异很大,在16Ss实验室中,拟杆菌属Bacteroidesspp.（相对丰度范围:0.3%-53.5%）,肠球菌属Enterococcus spp.（范围:0.8%-43.9%）和梭杆菌属Fusobacterium spp.（范围:0.1%-39.8%）的相对丰度变化范围最大;在SMs实验室中,多形态拟杆菌B.thetaiotaomicron的相对丰度变化范围（5.5%-53%）最大。在检测模拟群落样本201901中预设的低丰度细菌（两岐双歧杆菌B.bifidum）及模拟粪便悬液样本201904中定量添加的与结直肠癌有关联的具核梭杆菌 F.nucleatum时,SMs方法优于16Ss方法。主成分分析（PCA）和PERMANOVA分析显示,检测方案中使用的基因组DNA提取方法（破壁方法和提取试剂盒）、靶向扩增区域（适用于16Ss）和生物信息学分析工具（物种注释分类工具和参考数据库）的差异是造成实验室间结果不一致的重要因素。无论是16Ss还是SMs,外源微生物的污染始终是一个不可避免的问题。本研究中发现,分别有38.5%（10/26）和30.4%（7/23）的实验室在阴性对照样本中检测到了不同数量的微生物,且不同实验室检测到的污染微生物种类是不同的。这些污染微生物的来源可能包括分子生物学试剂（如DNA提取试剂、PCR试剂等）、研究人员体表、样本之间或实验室环境之间的交叉污染,以及生信分析的错误匹配等。在第二部分中,我们构建了共包含15种呼吸道感染相关微生物的1 1个模拟群落样本（S1-S11）,评估了 90个已经建立了 mNGS检测流程的实验室的检测能力。从调查问卷反馈的信息分析,各实验室用于本次模拟群落样本分析的检测方案的技术细节差异很大。对各实验室的检测结果统计发现,在包含14种微生物的样本S1中,对于浓度达到1×106或1×107 cell/ml的微生物,结果为阳性的实验室比例均超过了 92%。相比之下,只有不到50%的实验室可以检测到浓度为1×103 cell/ml或更低的微生物。对于每种微生物,每个实验室报告的RPM值的差异很大。例如,在样本S1中,流感嗜血杆菌H.influenzae和肺炎链球菌S.pneumoniae的 RPM 中位数分别为 17556.9（范围:0.3-330310）和 24977.3（范围:0.5-962186.2）。在利用mNGS对低微生物量样本（S2-S4）的检测中,引入宿主DNA去除过程会导致低浓度微生物检出率的下降,而增加珠磨破壁过程则可以增加低浓度微生物的产量,特别是对于像烟曲霉A.fumigatus这样具有坚硬细胞壁的真菌。在利用mNGS鉴别样本S5-S7中遗传组成上相似的微生物（金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌）时,只有56.6%（43/76）到63.0%（51/81）的实验室计算的RPM 比率（RPMS.aureus/RPMS.epidermidis）与理论比值的偏差较小（控制在上下2倍的变化范围内）。这说明,一些实验室的样本处理或数据分析过程需要进一步优化,以提高对样本中相似物种的准确鉴别和定量的能力。在3个模拟病例相关样本（S8-S10）的检测中,只有56.7%（51/90）到83.3%（75/90）的实验室能够给出明确的病原学诊断,说明不少实验室结合临床病例信息和mNGS检测结果从多微生物样本中识别出真正病原体的能力较差。和第一部分研究发现的一样,非目标微生物的检出（假阳性结果）同样是mNGS检测面临的一个问题。在这项研究中,有42.2%（38/90）的实验室共报告了多达306种非目标微生物。假阳性结果可能会严重干扰测序数据中真正病原体的检出和判断,尤其是对于低微生物量样本,所以实验室应该采取措施控制实验过程中的潜在污染及生信分析中的错误比对。综上所述,本研究在充分考虑了临床样本的生物学特征及影响高通量测序的关键样本因素后,分别构建了适用于肠道菌群多样性分析及病原体鉴定的高通量测序检测的参考样本盘,并进一步开展了全国范围的多中心质量评价研究。结果发现当前开展菌群多样性分析的16Ss和SMs实验室以及开展病原体鉴定的mNGS实验室的检测结果之间存在较大的差异。通过各实验室反馈的数据,我们分析了结果的变异来源并讨论了可能的解决方案,这有助于指导实验室针对性的开展方法学优化、整合和标准化,最终达到提高实验室检测能力的目的。本研究结果也说明了参考样本盘中的样本适用于目前的各类主流测序平台,能够从不同的角度考察方法学的性能特征。它们能够作为室间质评样本,用于评价不同实验室的检测能力,保证实验室间检测结果的准确性和可比性;同时可以作为室内质控样本,帮助实验室追踪日常检测过程中存在的问题,促进检测流程的优化和改进。