土茯苓醇提物生物活性及其功能性食品研究与开发

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土茯苓是双子叶植物菝葜的干燥根茎,《中国药典》(2020年版第一部)已将其收载。现代药理研究表明,土茯苓具有免疫调节、抗炎、抗氧化、抑菌、镇痛、利尿等活性,临床上常用于治疗湿热淋浊、筋骨疼痛、头痛、痛风等症状。同时,土茯苓也属于原卫生部规定的可用于保健食品的物品,具有除湿解毒,健脾胃等功效。本文以土茯苓为原料,对其乙醇提取工艺进行优化;探究了醇提物及落新妇苷的抑菌活性、抗氧化性,以及对胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用;以糖尿病小鼠为模型,研究了醇提物及落新妇苷的体内降血糖降血脂效果;研发土茯苓咀嚼片,为开发土茯苓功能性食品提供良好技术支撑。(1)土茯苓乙醇提取工艺优化以土茯苓为原料采用超声波法提取,高效液相色谱法测定提取液中的落新妇苷为定量指标。在单因素实验的基础上,采用BOX-Behnken响应面法考查乙醇浓度、料液比和超声时间对土茯苓提取液中落新妇苷含量的影响,以此确定土茯苓乙醇提取优化工艺。BOX-Behnken响应面法优化结果表明当乙醇浓度为67.7%,提取时间为87.5 min,料液比为1:10.3时,土茯苓提取液中的落新妇苷含量的预测值为0.0621mg/m L。实验验证结果显示预测值与实测值之间的平均偏差为1.61%,最终确定土茯苓中落新妇苷提取工艺为,提取时间90 min,乙醇浓度70%,料液比1:10,实验测定土茯苓提取液中落新妇苷平均含量为0.0614 mg/m L。(2)土茯苓醇提物和落新妇苷抑菌活性分别采用二倍稀释法和牛津杯法测定土茯苓醇提物、落新妇苷对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌效果,并且探究土茯苓醇提物中落新妇苷含量与其抑菌效果的量效关系。结果表明,土茯苓醇提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的MIC值分别为10 mg/m L,2.5 mg/m L,0.625 mg/m L;抑菌圈直径分别为14.80±1.20 mm,19.58±0.58 mm,20.91±0.52 mm,抑菌圈直径均大于空白对照(70%乙醇);落新妇苷浓度在3.125~25 mg/m L范围内,大肠杆菌的最大抑菌圈直径为12.30±0.92 mm,金黄色葡萄球菌的最大抑菌圈直径为14.98±0.48 mm,枯草芽孢杆菌的最大抑菌圈直径为16.02±0.98 mm。表明在实验测试浓度下醇提物及落新妇苷对3种供试菌株具有明显的抑制效果,并呈一定的量效关系。落新妇苷与醇提物中其他成分之间存在联合抑菌效果,尤其对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有显著联合抑菌优势。(3)土茯苓醇提物和落新妇苷体外抗氧化活性通过紫外分光光度法测定土茯苓醇提物和落新妇苷对DPPH自由基、羟基自由基的清除率以及总还原性。结果表明,醇提物对DPPH自由基和羟基自由基的最大清除率分别为86.64%和96.38%。在实验测试浓度下其IC50分别为0.35 mg/m L和0.55 mg/m L;落新妇苷对DPPH自由基和羟基自由基的最大清除率分别为75.36%和60%;醇提物的总还原能力A700显著优于阳性对照VC。表明醇提物和落新妇苷均具有一定的抗氧化活性,且醇提物的抗氧化活性显著优于落新妇苷。(4)土茯苓醇提物和落新妇苷体外抑制α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活性以酶标仪和荧光分光光度法测定醇提物和落新妇苷对α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的抑制作用及荧光强度的影响。结果表明,在实验测试浓度下醇提物对α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的最大抑制率分别为90.54%和72.73%,IC50分别为0.051 mg/m L和0.021 mg/m L。落新妇苷对两种酶的最大抑制率分别为31.2%和56.5%。通过绘制两种酶的荧光强度光谱图发现,随着实验浓度的不断增大,醇提物和落新妇苷可以与酶结合,逐渐熄灭两种酶的内源性荧光强度,引起最大发射波长红移。表明醇提物和落新妇苷对α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶具有一定的抑制效果,且醇提物的抑制作用大于落新妇苷。(5)土茯苓醇提物体内降血糖作用建立糖尿病小鼠模型,探究土茯苓醇提物及落新妇苷对糖尿病小鼠体重、血糖、肝脏指数、肾脏指数以及血清指标的影响。结果表明,与糖尿病对照组(MC)相比,阳性对照组(PC,二甲双胍)与醇提物高剂量组(RSG-H)对糖尿病小鼠体重下降有缓解效果,醇提物高剂量组(RSG-H)能显著降低糖尿病小鼠的血糖值(P<0.05)。与糖尿病对照组相比较,醇提物高剂量组、中剂量组和低剂量组小鼠血清中总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量显著降低(p<0.05);落新妇苷对糖尿病小鼠血清中的TC含量有显著性影响(p<0.05)。与糖尿病对照组相比较,醇提物高剂量组、醇提物中剂量组、醇提物低剂量组的肝脏指数显著降低(P<0.05),醇提物高剂量组的肾脏指数显著降低(P<0.05);落新妇苷组小鼠的肝脏指数显著降低(p<0.05),肾脏指数无显著性影响。表明醇提物具有明显的降血糖,降血脂作用,落新妇苷具有降血脂作用;醇提物可明显抑制糖尿病小鼠的肝脏肿大,醇提物高剂量能明显抑制糖尿病小鼠的肾脏肿大。(6)土茯苓醇提物咀嚼片工艺及质量研究以醇提物为主药,采用单因素试验对填充剂、矫味剂、湿润剂进行了筛选;采用混料设计试验研究处方中不同成分的不同配比组合对咀嚼片感官质量的影响,确定最佳处方。最终取0.205 g的醇提物,加入0.239 g预胶化淀粉,等量多次混匀,加入0.06 g微晶纤维素,混匀,再加入适量的70%乙醇制软材;湿法制粒(18目筛),50℃烘干7分钟,整粒,加入0.03 g木糖醇,0.045 g结晶麦芽糖醇,0.015 g柠檬酸,混合均匀,压片,制成土茯苓咀嚼片;制得的咀嚼片表面光滑圆整,色泽均匀,酸甜适中,口感良好。按照药典标准进行干颗粒和产品质量检测,质量分析表明咀嚼片的平均硬度为42.2 N,片重范围在0.570~0.630 g之间,片重差异检查、硬度检查均符合药典规定。干颗粒休止角平均值为28.15°,水分含量为4.93%,平均堆密度为0.3225 kg/m3,均符合药典要求。土茯苓咀嚼片中总黄酮的平均含量为12.48%,落新妇苷的含量为0.03496 mg/g。
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