依据本试验室构建的鸭瘟病毒基因文库及其测定的序列片段信息,设计UL28基因引物,PCR扩增出鸭瘟病毒UL28基因(GenBank登录号EF643557),分析了UL28基因的分子特征和密码子选择使用情况,并开展了以下研究工作:依据DPV UL28设计寡核苷酸探针,用斑点杂交进一步确认该UL28属于鸭瘟病毒基因组、原核表达和抗体制备、在病毒感染宿主鸭胚成纤维细胞中DPV UL28基因表达产物的亚细胞定位检测以及其转录时相分析。1.鸭瘟病毒UL28基因序列的分子特性分析DPV UL28大小为2412bp,编码803aa,包含1个保守结构域,名名为疱疹病毒加工和包装蛋白(PRTP)。DPV UL28基因(ICP18.5)与Genbank上多种α疱疹病毒同源基因的氨基酸序列具有较高的同源性。系统进化树分析表明,DPV在分类地位上归属于α疱疹病毒亚科,而且有可能属于新的属别分支。密码子偏爱性分析结果表明,编码相同氨基酸的密码子使用频率有较大的差异,在密码子的选择使用上表现出较强的偏爱性。2.DPV UL28基因原核表达及其多克隆抗体制备扩增的UL28基因连接至pMD18-T载体,将克隆片段测序正确后定向插入pET-32a(+)载体,经BamH I和Sal I双酶切鉴定表明,成功构建重组表达质粒pET-32a/UL28,并转化入表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,表达产物以包涵体形式存在,大小为110KD左右。对表达条件进行优化,确定最佳表达条件为IPTG 0.1mmol/L,25℃诱导5h。利用重组表达蛋白所带的6×His标签用镍柱亲和层析方法进行纯化,获得较高纯度的重组蛋白。过柱纯化蛋白对家兔进行免疫,制备兔高免血清,Western-Blotting检测显示,其能识别该重组表达蛋白;琼脂扩散试验效价达1:16～1:32。3.DPV UL28基因产物在宿主细胞中的表达与细胞定位通过细胞免疫荧光进行病毒感染DEF的细胞定位检测,结果表明特异性荧光可在感染后2h的胞核中检测到,随着感染时间的增加,越来越多的细胞核中出现特异性荧光,12h检测到最强荧光,主要见于细胞核。之后荧光强度逐渐减弱,病毒侵蚀伴随着细胞核的裂解,胞核荧光逐渐弥散减弱。48h后就难以检测到荧光。4鸭瘟病毒体外感染宿主细胞UL28基因的转录时相分析通过荧光定量PCR对DPV UL28基因在宿主细胞的转录时相检测结果表明,随着接毒时间的增加,DPV UL28基因的转录产物呈现先急剧上升,然后持续下降的趋势。最早在0.5h就已经检测到UL28基因开始转录,随后转录产物量迅速放大,并于感染后12h达到高峰,24h后其相对含量下降到一定水平,32h后检测相对值接近零。这种转录谱具有疱疹病毒早期基因的典型特征。