背景和目的天然的骨组织本质上是复杂的有机/无机复合物,有着显著的机械性能,高强度、高韧性。这些优越的性能归结于有机物和无机物的结合以及它们独特的具有严格等级的空间结构,即以有机胶原纤维支架为矿化模板,纳米羟基磷灰石有选择性的沿着胶原纤维长轴c轴定向沉积在胶原纤维内部。人们一直尝试以生物仿生（biomimetics）的思路,即通过体外模拟骨组织的形成过程,来合成骨替代材料。理想的骨替代材料应该具有和骨组织类似的结构和功能。近年来,不断有学者尝试用不同方法合成骨替代材料,即对生物仿生矿化模型的体外研究。过去,有学者将胶原支架浸泡于人工模拟体液（simulated body fluid,SBF）中,以模拟体内环境进行仿生矿化,但此种方法并未真正的模仿骨组织结构,因为矿物质大量存在于胶原纤维的表面,属于“top-down”的组装模式,即晶体成核过程迅速的发生在胶原纤维外部,由溶液中的离子聚集形成簇（cluster）,随着离子的不断吸附,cluster的体积持续增大,达到一定大小后成为临界晶核,再通过表面离子的继续沉积使得晶体不断生长。此种方式形成的矿化胶原缺乏韧性和强度。这一结果是由于缺乏类似于骨组织中非胶原蛋白（non-collagenous proteins,NCPs）的调控作用。在生物体中,蛋白的参与组成起着至关重要的作用,如输送原材料,无机物合成的酶促反应,调控无机物成核、生长及晶体形态等。在生物体矿化过程中,硬组织的非胶原蛋白含量虽然很少,但却对晶体的生长有着重要的调控作用。比如骨桥蛋白（osteopontin,OPN）和牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein,DMP-1）以及牙本质磷蛋白（dentin phosphophoryn,DPP）等。但是由于分离高纯度的天然蛋白过程复杂、价格昂贵等原因,越来越多的学者一直在探索非胶原蛋白的替代物用于模拟生物矿化,如聚天冬氨酸（polyaspartic acid,pAsp）和聚丙烯酸（polyacrylic acid,PAA）等。近年来,基因工程肽（genetically engineered peptide for inorganics,GEPIs）被广泛地应用于无机物材料的合成。在前期研究中,我们从牙釉质表面利用噬菌体表面展示技术淘选出EHABP这一小分子肽链,可以和无机界面的晶体有特异性的空间位点识别及空间构象匹配,并对其成核、晶化过程有着良好的调控作用。在本文中,我们探索了利用小分子肽链EHABP有效地稳定及诱导无定形磷酸钙,并通过PILP的作用渗透扩散至胶原纤维内部,从而引导胶原纤维内的矿化的体外仿生矿化模型的研究。与此同时,与PAA诱导的矿化胶原的进行比较,证实了 EHABP在稳定无定形磷酸钙以及诱导纤维内矿化中的显著作用,同时也探索了 EHABP在此过程中可能的作用机制。材料和方法第一部分将合成纯度为95%的小分子肽EHABP（Mw:954.06g/mol）的粉末溶解于去离子纯水中,稀释浓度为10mmol/L,充分振荡混匀后4℃保存备用。参照Gower等人提出的PILP溶液的配制方法,预先配制2L的pH为7.4的TBS缓冲液,分装在两个1L的器皿中,将CaC12·2H20和K2HP04分别加入体积1L的TBS缓冲液中,振荡混匀。混匀后,将含有EHABP的CaC12·2H20溶液与K2HP04溶液等体积混合（EHABP体积较小,可忽略不计）。使得钙离子的终浓度为4.5mM,磷酸根离子的终浓度为 2.1mM,EHABP 的终浓度为 0.lmM、0.2mM、0.4mM 和 0.8mM。同EHABP小分子肽矿化液的配制方法,将PAA（1800g/mol）粉末加入钙离子溶液,之后与磷酸根离子溶液等体积混合,PAA的终浓度为500μg/mL。矿化液配制好后,放置于4℃保存备用。配置好矿化液后,准备进行溶液的浑浊度（optical density）的检测,溶液的浑浊度数值越高,说明溶液的稳定性越差,溶液中的颗粒越大。将不同浓度的EHABP矿化液滴入96孔板,室温25℃下进行分光光度计的检测,波长为590nm。检测的时间点为Od（即钙离子溶液与磷酸根离子溶液混合之后立即测量）、10d、20d和30d,并绘制曲线。对照组为PAA矿化液和未加入聚合物的空白钙磷溶液。将EHABP矿化液和PAA矿化液以及空白钙磷溶液放置15天后,肉眼可观察到溶液是否澄清或浑浊,即肉眼观察三种溶液的稳定情况。接下来用电子透射电镜（transmission electron microscopy,TEM）来观察溶液中的颗粒情况。第二部分将Ⅰ型胶原完全浸泡在EHABP矿化液中进行矿化,在不同时间段将EHABP矿化胶原捞出进行检测,包括透射电镜（transimission electron microscopy,TEM）、扫描电镜（scanning electron microscopy,SEM）、扫描透射电子显微镜（scanning transimission electron microscopy,STEM）、X射线衍射（X-Ray diffraction,XRD）、热重分析（thermo gravimetric and differential thermal analysis,TG/DTA）、光电子能谱分析（X-ray photoelectron spectroscopy,XPS）。多种的检测手段用于证实EHABP稳定无定形磷酸钙从而诱导的纤维内的矿化,观察纤维内部矿化物的存在情况,矿物质的量,以及矿物质的成分等。此外,为了检测EHABP小分子肽与Ⅰ型胶原纤维支架的结合情况,我们将异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate,FITC）标记在EHABP肽链上,用激光共聚焦显微镜（Laser confocal fluorescence microscopy,LCFM）进行观察。第三部分同EHABP矿化胶原的矿化方法,将Ⅰ型胶原完全浸泡在PAA矿化液中进行矿化,并在相同时间段将胶原捞出进行检测,包括扫描电镜（scanning electron microscopy,SEM）、透射电镜（transimission electron microscopy,TEM）、热重分析（thermo gravimetric and differential thermal analysis,TG/DTA）。从表征检测中,对EHABP矿化胶原和PAA矿化胶原进行比较。结果1.通过对EHABP矿化液浑浊度OD值的检测,证实了低浓度EHABP可以稳定无定形磷酸钙,稳定时间约为14天,这一时间足以使无定形磷酸钙通过PILP的作用渗透到胶原纤维内部,从而诱导纤维内的矿化。2.通过EHABP与无定形磷酸钙的结合,形成无定形EHABP-ACP复合物,通过PILP的作用吸附到胶原表面进而渗透到胶原纤维内部,经过一定时间的相变,纳米羟基磷灰石沿着胶原纤维的长轴c轴有规则的排列在胶原纤维内部。TEM的观察证实了这一结果。3.在体外胶原矿化的模型中,EHABP矿化胶原与PAA矿化胶原进行了部分比较,在TEM结果中,用EHABP稳定的无定形磷酸钙形成了较小的颗粒,更有利于快速地渗透进入胶原纤维内部,促进了矿化过程,同时热重分析TGA的检测显示EHABP的矿化胶原有55%以上的矿化量。说明了 EHABP可以有效地诱导纤维内的矿化。结论通过将EHABP加入矿化液形成稳定的无定形磷酸钙,进而通过PILP的作用扩散渗透至胶原内部诱导胶原纤维内的矿化。多种检测方法如TEM、SEM、STEM、TGA、OD等证明了 EHABP稳定无定形磷酸钙的有效性以及成功地建立了体外矿化Ⅰ型胶原模型,构建了具有等级结构的胶原支架。因此,我们认为EHABP作为NCPs的替代物,可以有效地稳定无定形磷酸钙,诱导纤维内矿化,使矿化胶原模拟了骨组织的基本结构,为生物仿生矿化材料提供了新思路,同时也在骨缺损的修复应用中有着巨大潜能。