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双表达系统与单一表达系统相比,具有较大的优势,可以启动细胞核,同时表达两外源基因。生长抑素-皮质抑素真核双表达DNA疫苗,可以在真核细胞中同时表达生长抑素-乙肝表面抗原（S/2SS）和皮质抑素-乙肝表面抗原（S/CST14）两种融合蛋白质,可以刺激机体分别产生抗生长抑素（Somatostatin,SS）和皮质抑素（Cortistatin,CST）的两种抗体,同时中和内源性生长抑素和皮质抑素,进而促进生长。因此在理论上,生长抑素和皮质抑素双表达DNA疫苗的促生长效果应比单表达DNA疫苗强。本研究应用基因克隆、细胞培养、RT-PCR、细胞免疫荧光、Western blot和ELISA等技术,将皮质抑素14肽基因连接在乙肝表面抗原3’端和双拷贝生长抑素乙肝表面抗原片段克隆到具有IRES元件的双表达pIRES质粒上,构建生长抑素-皮质抑素真核双表达质粒（pIRES-S/CST14-S/2SS,以下简称双表达质粒）。然后,转染Hela和GH3细胞,以鉴定该质粒在真核细胞中的表达情况。最后,采用肌肉注射方式将3种浓度的双表达DNA疫苗免疫4周龄的昆明雌鼠,并以2种单表达质粒及其联合免疫、以及本实验室成功构建并鉴定为最好的生长抑素DNA疫苗（pVGS/2SS-asd）、空质粒、生理盐水为对照,通过检测血浆中抗SS抗体、GH、CST水平以及增重,旨在探讨双表达疫苗的免疫效果和作用机制,摸索最优免疫方法,进一步提高现有疫苗的效果和安全性。主要研究内容和结果如下:1.双表达质粒pIRES-S/CST14-S/2SS的构建与鉴定人工合成14肽皮质抑素-乙肝表面抗原S片段融合表达基因片段S/CST14,与已有的双拷贝生长抑素-乙肝表面抗原片段融合表达基因片段S/2SS分别克隆到双表达质粒pIRES的MCSA和MCSB位点上,成功构建了生长抑素和皮质抑素双表达质粒,即pIRES-S/CST14-S/2SS。双酶切和测序结果鉴定表明,基因的插入点、方向和顺序完全正确。将质粒用脂质体转染到Hela细胞中,运用RT-PCR、细胞免疫荧光和Western-blot方法证实:转录产物有S/CST14（729bp）和S/2SS片段（789bp）,转染后48h观察到绿色荧光,且在WB方法中,表达的融合蛋白S/CST14（26KDa）和S/2SS（28KDa）能与对应的皮质抑素和生长抑素抗体结合,表明该质粒可以在真核细胞中表达。2.双表达质粒转染GH3细胞对GH和PRL及其受体表达的影响将质粒pIIRES-S/CST14-S/2SS转染到GH3（大鼠垂体瘤）细胞中,应用细胞免疫荧光、Western-blot、间接双抗夹心ELISA法检测生长抑素融合蛋白S/2SS和皮质抑素融合蛋白S/CST14在GH3细胞的表达、以及cAMP和生长抑素受体（SSTR1-5）的表达情况。结果表明,PIRES-S/CST14-S/2SS质粒能够在GH3细胞中表达融合蛋白S/CST14（26KDa）和S/2SS(28KDa。cAMP检测结果表明,表达产物均可调控GH3细胞,使上清液的GH和PRL显著性降低（P＜0.05）;SSTR1、SSTR3和SSTR5受体表达量均比单表达（CST和SS）显著性增加（P＜0.05）,而SSTR2与SSTR4两个受体双表达组与单表达CST组相比有所降低,推测两种表达产物对SSTR有协同作用。这些结果表明,双表达质粒能够同时表达具有SS和CST活性的融合蛋白,可抑制垂体瘤细胞GH和PRL的分泌。3.双表达质粒免疫小鼠的免疫应答和促生长效果选用三种浓度的双表达质粒（PIRES-S/CST14-S/2SS）、相当于双表达质粒中剂量的单表达皮质抑素质粒（PIRES-S/CST14）、单表达生长抑素质粒（pIRES-S/2SS）,进行单独和联合免疫组合,并以本室现有含平衡致死系统的生长抑素基因疫苗pVGS/2SS-asd（0.2 ×1010CFU/只）为阳性对照,以空载体pIRES质粒和生理盐水为阴性对照,分别免疫4w昆明雌性小鼠（n=180）,初免后间隔1w进行加强免疫。通过检测抗SS抗体（IgG）、GH和CST水平,发现双表达DNA疫苗低剂量组（10μg/100μl）在免疫后8w的总增重效果比阳性对照组高8.8%,虽然双表达质粒低剂量组的抗SS抗体阳性率比阳性组低15%,但是在阳性鼠抗SS抗体最大值和平均值均高于阳性对照。结果表明,生长抑素-皮质抑素双表达DNA疫苗在低剂量组可以产生相对较好的免疫应答反应和增重效果,但是如何提高该疫苗的免疫阳性率仍需进一步研究。4.双表达质粒免疫小鼠的安全性研究在免疫后8周,采用脊柱脱臼法处死小鼠,采集心、肝脏、脾、肺、肾、大脑、小肠、肌肉、卵巢共9个组织,提取组织总DNA,用PCR方法检测双表达质粒是否会整合到动物组织的基因组中,以判定疫苗的安全性。结果表明,pIRES-S/CST14-S/2SS质粒整合到动物组织DNA的概率（7.5×10-8）是极低的（PCR灵敏度:10拷贝/1μg基因组DNA）。5.基因免疫方法学研究为了确定双表达质粒的最适免疫方式,用实验室已经构成并鉴定为最优的疫苗减毒猪霍乱沙门氏菌生长抑素（SS）DNA疫苗（pVGS/2SS-asd）免疫小鼠,以RT-PCR方法借用基因探针确定生长抑素基因疫苗质粒的生物分布和数量,比较口服和肌肉注射两种给药方式以及免疫剂量的效果,发现肌肉注射组所诱导的特异性IgG抗体（IgG,IgG1,的IgG2a和IgA）总量显著增加,IgG1/IgG2a比例增大,出现典型的Th2型体液免疫反应;C501（pVGS/2SS-asd）质粒在注射部位的肌肉中分布时间达到7周的持久性。此外,肌肉注射疫苗接种与口服免疫比较,整个实验期间表现出较高的峰值（4 week）和较高的DNA拷贝数。因此通过提高生长抑素DNA疫苗在小鼠肌肉组织中的质粒拷贝数可以有效地提高生长抑素DNA疫苗的促生长作用和免疫抗体水平。