研究背景与目的近年来,以基因分型为基础的个体化的分子靶向治疗已成为非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer, NSCLC）里程碑式的治疗方案。其中最具代表性的是：针对表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor, EGFR）基因突变开展的分子靶向治疗。具有EGFR敏感突变的NSCLC患者接受酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）治疗,其有效率高达700%。但是,大部分患者在持续用药约1年时会出现"TKIs获得性耐药”,最终致使肿瘤复发或进展,严重影响了靶向治疗的效果和患者预后。 TKIs获得性耐药的分子机制主要为"T790M继发性突变”和"MET异常扩增”。研究发现,约50%TKIs获得性耐药患者出现T790M突变,约22%发生MET基因扩增,此两者可独立或同时出现,约占总获得性耐药的60%。此外,肿瘤抑制基因PTEN的表达缺失、肿瘤细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）、Axl激活、小细胞肺癌转化等机制也可导致TKIs获得性耐药。如何针对获得性耐药机制进行早期分子诊断并有效分子干预是临床上亟待解决的问题。 miRNAs （microRNAs）是一类长度约为22个核苷酸的小分子非编码RNA,其可通过与靶基因mRNA3’非编码区（Untranslated Regions, UTR）的互补结合,抑制靶基因mRNA翻译或促进mRNA降解来下调靶基因的表达。越来越多的研究发现,miRNAs的表达改变能引起抑癌基因或原癌基因的表达异常,继而调节增殖、凋亡、分化及代谢等肿瘤恶性生物学行为,促使肿瘤细胞侵袭转移。在miRNAs参与TKIs获得性耐药的研究领域中,Garofalo等在《Nature Medicine》杂志中阐述了重要耐药机制“MET基因扩增”调节的miRNAs对获得性耐药的调控作用。此研究提示miRNAs有潜力成为TKIs获得性耐药的分子干预靶点。 既然miRNAs在肿瘤的发生发展及TKIs耐药中可起到重要的调节作用,同时有鉴于TKIs耐药机制复杂多样,那么在其它原因引起的TKIs耐药中是否与miRNAs的表达异常及调控有关?miRNAs调控TKIs获得性耐药的作用机制是什么?这些问题尚未有答案!因此,本探究将通过miRNA芯片筛选PC9（吉非替尼敏感细胞）与PC9GR（吉非替尼获得性耐药细胞）之间差异性显著的miRNAs,研究miRNAs对TKIs耐药的调控作用,并探讨其在TKIs耐药中的机制。 实验方法 1.通过ARMS去检测PC9GR细胞EGFR基因突变；0μM、0.1μM、2μM、5μM、10μM的吉非替尼（Gefitinib）干预PC9和PC9GR细胞,用CCK8、western blot法检测细胞对Gefitinib的敏感性及Gefitinib干预后p-EGFR、p-ERK、 p-AKT的蛋白表达变化；microarray筛选PC9和PC9GR之间差异表达miRNAs并经qRT-PCR验证；在PC9和PC9GR细胞中干预miR-181a表达后,通过CCK8法检测细胞对Gefitinib敏感性的变化,通过Transwell检测细胞侵袭转移能力的变化,通过western blot检测p-ERK和p-AKT蛋白表达变化,通过qRT-PCR和western blot检测侵袭转移相关分子的表达变化。 2.通过qRT-PCR检测47例NSCLC癌组织及其对应的正常组织中miR-181a的表达水平,比较癌组织与正常组织之间miR-181a的表达差异,并分析肿瘤组织中miR-181a表达水平与临床病理特征之间的关系； 3.通过Targetscan/miRnada生物信息学预测工具,预测miR-181a可能的靶基因;在PC9和PC9GR细胞中干预miR-181a表达后,通过qRT-PCR和western blot法筛选miR-181a可能调节的靶基因；荧光素酶报告基因法验证miR-181a的靶基因；qRT-PCR和western blot检测miR-181a和GAS7在NSCLC中的表达,并分析两者之间的相关性。 4.通过western blot检测GAS7在PC9和PC9GR中的表达差异、并检测siRNA-GAS7对PC9及pcDNA3.1-GAS7对PC9GR GAS7蛋白表达的影响；以PC9为研究对象,实验分为三组,分别为miR control/pcDNA3.1、miR-181a mimics/pcDNA3.1、miR-181a mimics/pcDNA3.1-GAS7,通过BrdU和流式细胞学检测细胞对Gefitinib敏感性,并利用IHC和western blot检测共转染后EMT相关分子和细胞信号通路的变化；以PC9GR为研究对象,实验分为三组,分别为inhibitor control/si-NC、miR-181a inhibitor/si-NC、miR-181a inhibitor/si-GAS7,通过BrdU和流式细胞学检测细胞对Gefitinib敏感性,并利用IHC和western blot检测共转染后EMT相关分子和细胞信号通路的变化。 5.通过免疫组化法（immunohistochemistry, IHC）检测59例NSCLC肿瘤组织GAS7蛋白表达,并分析GAS7蛋白表达与NSCLC I临床病理特征之间的关系；结合生存资料通过单因素分析及多因素分析探讨GAS7与NSCLC预后之间的关系；通过Oncomine和GEO生物信息学数据库分析GAS7在NSCLC肿瘤及正常组织中的表达差异,并在GEO数据库中分析GAS7与耐药相关基因VEGF、PTEN和MET之间的相关性。 实验结果 1. miR-181a调节PC9和PC9GR对Gefitinib的敏感性 通过高敏感性的ARMS法,我们发现PC9GR只含有19号外显子E746-A750缺失突变,而无T790M突变。CCK8检测发现PC9对Gefitinib高度敏感,随Gefitinib药物浓度的增加,细胞生长被明显抑制,而PC9GR对Gefitinib产生耐药。Western blot检测信号通路发现PC9细胞p-EGFR、 p-ERK和p-AKT的蛋白表达水平随Gefitinib浓度增加而被明显抑制；在PC9GR细胞中,p-ERK和p-AKT的蛋白表达未被Gefitinib抑制,而p-EGFR的蛋白表达在Gefitinib浓度增加至5gM/L时被明显抑制。通过芯片筛选发现,miR-181a表达水平在PC9GR细胞中显著高于PC9,提示miR-181a表达上调可能参与调节Gefitinib耐药。CCK8显示PC9转染miR-181a mimics后对Gefitinib敏感性降低,而PC9GR转染miR-181a inhibitor后对Gefitinib敏感性增高。Transwell检测发现PC9细胞转染miR-181a mimics后,侵袭转移能力显著增加；而PC9GR细胞转染miR-181a inhibitor后,侵袭转移能力下降。Western blot显示PC9转染miR-181a mimics后,p-ERK和p-AKT蛋白表达增加,而PC9GR转染miR-181a inhibitor后,p-ERK和p-AKT蛋白表达降低。此外,qRT-PCR和western blot显示PC9转染miR-181a mimics后,促肿瘤转移分子表达增加,而PC9GR转染miR-181a inhibitor后,促肿瘤转移分子表达下降。 2. miR-181a在NSCLC中的表达及意义 通过qRT-PCR检测47例NSCLC癌组织及对应正常组织中miR-181a的表达发现,36例患者癌组织中miR-181a表达高于对应正常组织（36/47,76.6%）,miR-181a在NSCLC癌组织中的表达水平为对应正常组织的2.45倍,显著高于正常组织（P＜0.0001）。进一步分析肿瘤组织中miR-181a表达与NSCLC临床病理特征之间的关系发现,miR-181a高表达与吸烟（P=0.0498）、T2-T4分期（P=0.0458）、P53阳性（P=0.0209）及Ki67＞30%（P=0.0222）显著相关,而与年龄（P=0.1742）、性别（P=0.0722）、分化程度（P=0.9067）、病理类型（P=0.1029）、N分期（P=0.2540）和TNM分期（P=0.5529）无关。 3.GAS7是miR-181a的靶基因 通过Targetscan/miRnada生物信息学工具预测miR-181a可能的靶基因,并经qRT-PCR和western blot检测发现,PC9转染miR-181a mimics后GAS7表达显著降低,而PC9GR转染miR-181a inhibitor后GAS7表达显著增加。荧光素酶报告基因实验显示,miR-181a mimics和miR-181a inhibitor显著影响野生型pMIR-reporter-GAS73’UTR报告基因荧光素酶活性,而对突变型报告基因荧光素酶活性无影响o qRT-PCR和western blot检测miR-181a和GAS7相关性发现,miR-181a与GAS7mRNA和GAS7蛋白表达呈负相关。 4. miR-181a通过GAS7调节PC9和PC9GR对Gefitinib敏感性 Western blot显示GAS7蛋白表达水平在PC9GR中低于PC9。BrdU和流式细胞学检测显示,PC9细胞转染miR-181a mimics后对Gefitinib敏感性降低,而在miR-181a mimics转染后过表达GAS7可重新促使PC9对Gefitinib敏感；PC9GR转染miR-181a inhibitor后对Gefitinib敏感性增加,而在miR-181a inhibitor转染后沉默GAS7可再次降低PC9GR对Gefitinib的敏感性。IHC和Western blot显示,PC9转染miR-181a mimics后过表达GAS7可逆转miR-181a mimics的干预效果；同样,PC9GR转染miR-181a inhibitor后沉默GAS7可逆转miR-181a inhibitor对PC9GR的干预效果。 5.GAS7在NSCLC中的表达及其意义 59例NSCLC中,腺癌GAS7蛋白高表达比例显著高于鳞癌（P=0.001）；TNM Ⅰ期中GAS7蛋白高表达比例显著高于Ⅱ期和Ⅲ期（P=0.033）,而GAS7蛋白表达与性别、年龄、分化程度、肿瘤大小和淋巴结转移无明显关系（P＞0.05）。Kaplan Meier生存曲线显示GAS7蛋白高表达患者总体生存时间显著优于GAS7蛋白低表达患者（P=0.0315）。多因素分析显示TNM分期为NSCLC患者预后的独立危险因素。分析Oncomine数据库入组的8项研究,有7项研究显示肿瘤组织中GAS7mRNA表达水平显著低于正常组织（P＜0.001）；进一步对GEO数据库中GSE31210分析,GAS7与TKIs耐药相关基因MET （rpearson=-0.205,P=0.0020）、PTEN （rpearson=0.431, P＜0.0001）及VEGF （rpearson=-0.264, P＜0.0001）呈显著相关。 结论 1.miR-181a在Gefitinib耐药细胞PC9GR中表达增加,其可通过ERK和AKT信号通路,调节细胞增殖及侵袭转移能力,进而影响NSCLC对Gefitinib的敏感性。 2.我们认为miR-181a在NSCLC癌组织中表达增加参与NSCLC的发生发展。 3.GAS7是miR-181a的靶基因,miR-181a通过GAS7调节PC9和PC9GR对Gefitinib敏感性； 4.我们认为GAS7在NSCLC中表达降低参与NSCLC的发生发展,其在NSCLC中调节TKIs耐药可能与MET、PTEN及VEGF有关,